Lektsia_7_Tormozhenie_immunnogo_otveta


ЛЕКЦИЯ 7. ТОРМОЖЕНИЕ В ИММУННОЙ СИСТЕМЕ. АПОПТОЗ
Содержание
1. Сигнальная фаза апоптоза. Рецептор-зависимый сигнальный путь
2. Сигнальная фаза апоптоза. Митохондриальный сигнальный путь
3. Эффекторная фаза апоптоза4. Деградационная фаза апоптозаАпопто́з (др.-греч. ἀπόπτωσις — опадание листьев) — регулируемый процесс программируемой клеточной гибели, в результате которого клетка распадается на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро (в среднем за 90 минут) фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции. Морфологически регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1—3 часа.
Функции апоптоза:
1. Уничтожение дефектных (повреждённых, мутантных, инфицированных) клеток
2. Участие в процессах дифференциации и морфогенеза
3. Участие в поддержании клеточного гомеостаза
4. Обеспечение развития и функционирования иммунной системы.
Исследования программируемой клеточной смерти ведутся с конца 1960-х годов. Термин «апоптоз» был впервые употреблён в 1972 году в работе британских учёных — Дж. Керра, Э. Уайли и А. Керри. Одними из первых к изучению генетики и молекулярных механизмов апоптоза приступили С. Бреннер, Дж. Салстон и Р. Хорвиц, все трое в 2002 году были удостоены Нобелевской премии по физиологии. В настоящее время установлены основные механизмы реализации апоптоза в эукариотических клетках, активно ведутся исследования регуляторов и активаторов апоптоза. Интерес учёных связан с возможностью применения знаний о программируемой клеточной смерти в медицине при лечении онкологических, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний.
Фазы апоптоза:
1. Сигнальная фаза
Рецептор-зависимый сигнальный путь
Митохондриальный сигнальный путь
2. Эффекторная фаза: Каспазный каскад
3. Деградационная фаза
1. Сигнальная фаза апоптоза. Рецептор-зависимый сигнальный путь
Факторы, инициирующие апоптоз: апоптоз возникает в результате гипоксии, гипероксии, некротического поражения химическими или физическими агентами, перекрёстного связывания соответствующих рецепторов, нарушения сигналов клеточного цикла, удаления факторов роста и метаболизма.
Выделяются два основных пути передачи сигнала апоптоза: рецептор-зависимый (внешний) сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный (собственный) путь.
Механизм сигнальной фазы апоптоза:
Процесс апоптоза начинается с взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Сигналы к апоптозу лимфоцитов – Лиганды: Глюкокортикоиды, Фактор некроза опухолей (TNF - Факторы некроза опухоли, или семейство ФНО), FAS-лиганд (sFASL), TRAIL трансмембранный белок, CD30 (Ki-1), CD40L, Цитокин TWEAK
Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов (англ. tumor necrosis factor receptor или кратко TNFR — «рецептор фактора некроза опухолей»). Рецепторами смерти являются CD95 (также известный как Fas или APO-1) и TNFR1 (также называемый p55 или CD120a). К дополнительным относятся CARI, DR3 (англ. death receptor 3 — «рецептор смерти 3»), DR4 и DR5. Все рецепторы смерти представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене. Данная последовательность называется доменом смерти (англ. death domain или кратко DD) и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза.
Участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримерами лигандов. Тримеры лигандов в результате взаимодействия тримеризуют рецепторы смерти (то есть «сшивают» 3 молекулы рецептора). Активированный таким образом рецептор взаимодействует с соответствующим внутриклеточным адаптером (или адаптерами).
Для рецептора CD95(Fas/APO-1) адаптером является FADD (от англ. Fas-associated DD-protein — «белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора»). Для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD (от англ. TNFR1-associated DD-protein — «белок, взаимодействующий с доменом смерти TNFR1-рецептора»).
Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами — пока ещё неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз — с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспаз. Данные агрегаты именуются апоптосомами, апоптозными шаперонами или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (от англ. DISC — death-inducing signaling complex — «сигнальный комплекс, индуцирующий смерть»).
Рецепторы смерти, адаптеры и эффекторы взаимодействуют между собой сходными по структуре доменами: DD, DED, CARD. DD (от англ. death domain — «домен смерти») участвует во взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD. Посредством домена DED (от англ. death-effector domain — «домен эффектора смерти») осуществляется взаимодействие адаптера FADD с прокаспазами −8 и −10. Домен CARD (от англ. caspase activation and recruitment domain — «домен активации и рекрутирования каспазы») участвует во взаимодействии адаптера RAIDD с прокаспазой-2.
Посредством рецепторов смерти могут быть активированы три инициирующие каспазы: −2; −8 и −10. Активированные инициирующие каспазы далее участвуют в активации эффекторных каспаз. Эффекторные каспазы участвуют в разрушении клеточных структур. Разрушается цитоскелеа, происходит фрагментация ДНК и нарушение функционирования митохондрий. Клетка сморщивается, однако мембрана ее остается интактной, но повреждение ее приводит к активации фагоцитоза. Погибшие клетки распадаются на небольшие окруженные мембраной фрагменты, которые обозначаются как апоптотические тельца. Воспалительная реакция на апоптотические клетки не возникает.

Схема передачи сигналов апоптоза при посредстве рецепторов смерти CD95, TNFR1 и DR3
2. Сигнальная фаза апоптоза. Митохондриальный сигнальный путь
Большинство форм апоптоза у позвоночных реализуется по митохондриальному пути, а не через рецепторы клеточной гибели. Митохондриальный сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки. Высвобождение апоптогенных белков осуществляется двумя путями: за счёт разрыва митохондриальной мембраны или путём открытия каналов на внешней мембране митохондрий.
Ключевым событием митохондриального пути апоптоза является повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий. Существенную роль в повышении проницаемости играют апоптотические Bcl-2 белки — Bax и Bak. Они встраиваются в наружную мембрану митохондрий и олигомеризуются. При этом нарушается целостность внешней мембраны митохондрий. При повышении проницаемости из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль высвобождаются растворимые белки, участвующие в апоптозе: цитохром С, прокаспазы −2, −3 и −9; белок AIF (от англ. en:apoptosis inducing factor — «фактор индуцирующий апоптоз»).
Разрыв внешней мембраны митохондрий объясняется увеличением объёма митохондриального матрикса. Данный процесс связывают с раскрытием пор митохондриальной мембраны, приводящим к снижению мембранного потенциала и высокоамплитудному набуханию митохондрий вследствие осмотического дисбаланса. Поры способны пропускать низкомолекулярные вещества. Раскрытие пор стимулируют следующие факторы: неорганический фосфат; каспазы; SH-реагенты; истощение клеток восстановленным глутатионом; образование активных форм кислорода; разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями; увеличение содержания Ca2+ в цитоплазме; воздействие церамида; истощение митохондриального пула АТФ и др.
Цитохром c в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы вместе с белком APAF-1 (от англ. Apoptosis Protease Activating Factor-1 — «активирующий фактор апоптотической протеазы-1»). Предварительно, APAF-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. APAF-1 связывает цитохром С. К тому же открывается доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9. В итоге происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка APAF-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.

Модель образования апоптосомы«Цитохром c — APAF-1 — CARD — прокаспаза-9»
3. Эффекторная фаза апоптозаВ течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвертируются в один общий путь апоптоза. Происходит активация каскада белков-эффекторов и регулирующих их белков-модуляторов. Основными эффекторами апоптоза являются каспазы. В процессе активации они запускают каспазный каскад: сложно переплетённые цепочки взаимодействий инициирующих и эффекторных каспаз. Каспазный каскад - схематическая последовательность активации каспазы путём протеолитического расщепления прокаспазы на большую и малую субъединицы с их последующей ассоциацией.
Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные последовательности после остатка аспарагиновой кислоты. Каспазы образуются за счёт активации прокаспаз. Активация происходит путём протеолитического процессинга: все три домена расщепляются, отделяется продомен, а оставшиеся большая и малая субъединицы ассоциируются, образуя гетеродимер. Два гетеродимера в дальнейшем формируют тетрамер — полноценную каспазу с двумя каталитическими участками.
Каспазы обнаружены в большинстве живых организмов. У млекопитающих идентифицировано 13 каспаз. Часть из них в апоптозе не участвует (−1, −4, −5, −11, −13). Остальные каспазы, которые участвуют в апоптозе, разделяют на инициаторные (−2, −8, −9, −10, −12) и эффекторные (−3, −6, −7). Инициаторные каспазы активируют эффекторные каспазы, которые в свою очередь провоцируют и непосредственно участвуют в трансформации клетки. В итоге морфологические и биохимические изменения приводят к гибели клетки по типу апоптоза.
Функции каспаз:
1. Разрушение клеточных структур. Гидролизу подвергаются белки ядерной ламины, разрушается цитоскелет, расщепляются белки, регулирующие клеточную адгезию.
2. Инактивация белков, блокирующих апоптоз. В частности расщепляется ингибитор DFF (англ. DNA fragmentation factor — «фактор фрагментации ДНК»), препятствующий активации апоптозной ДНКазы CAD (англ. caspase-activated DNase — «ДНКаза, активируемая каспазами»). Разрушению подвергаются и антиапоптозные белки семейства Bcl-2.
3. В результате действия эффекторных каспаз происходит диссоциация регуляторных и эффекторных доменов, участвующих в репарации ДНК, мРНК-сплайсинга и ДНК-репликации.
Дополнительные эффекторы апоптоза. Помимо каспаз существуют и другие эффекторы апоптоза. Например, флавопротеин AIF, высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий, действует по независимому от каспаз пути. Попадая в клеточное ядро, AIF вызывает конденсацию хроматина и активирует эндонуклеазы, которые участвуют во фрагментации ДНК. в присутствии AIF, не предотвращается ингибитором каспаз (Z-VAD-fmk).
В качестве эффекторов апоптоза также рассматриваются кальпаины — представители семейства цитозольных Ca2+-активируемых цистеиновых протеаз. Их роль в апоптозе пока слабо охарактеризована.

Схематическая последовательность активации каспазы путём протеолитического расщепления прокаспазы на большую и малую субъединицы с их последующей ассоциацией
4. Деградационная фаза апоптозаИтогом программируемой клеточной гибели является деградация клетки путём фрагментации на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро (в среднем за 90 минут) фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции.
1. Первая стадия – преапоптоз. На этой стадии происходит уменьшение размеров клетки за счет ее сморщивания, возникают обратимые изменения в ядре (уплотнение хроматина и скопление его по периферии ядра). В случае воздействия некоторых специфических регуляторов апоптоз может быть остановлен, и клетка возобновит свою нормальную жизнедеятельность.
2. Вторая стадия – собственно апоптоз.
1. Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы. Этот фермент вызывает прогрессивное образование связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия.
2. Конденсация хроматина. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро же может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм конденсации хроматина обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов.
3. Формирование в цитоплазме полостей и апоптотических телец. В апоптотической клетке первоначально формируются глубокие впячивания поверхности с образованием полостей, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра. Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками, или паренхиматозными, или макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство. Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на этих клетках: они захватывают и поглощают апоптотические клетки.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АПОПТОЗА
Апоптоз– это программируемая, генетически опосредованная форма клеточной гибели, при которой внешние или внутренние сигналы дают импульс клетке к образованию или активации ферментов, приводящих ее к самоуничтожению.
Сигналы к апоптозу (Лиганды)
1. FAS-лиганд (sFASL)
2. TRAIL трансмембранный белок
3. CD30 (Ki-1)
4. CD40L
5. Цитокин TWEAK
Рецепторы к сигналам апоптоза:
1. Растворимый FAS (sFas) FAS, также называемый CD95 или APO-1
2. DR5 (Death Receptor) «Рецепторы смерти»
Регуляторы апоптоза:
Bcl-2
Белок р53
Семейство каспазБелки теплового шока (HSP)
1. Характеристика сигналов к апоптозу лимфоцитов (Лиганды):
1. FAS-лиганд (sFASL) FAS-лиганд, известный как «фактор смерти», связывается с FAS-рецептором и индуцирует гибель клеток: уничтожение зрелых Т-клеток на завершающих стадиях иммунного ответа, киллинг опухолевых или инфицированных вирусом клеток цитотоксическими T-лимфоцитами и NK-клетками. Потеря функциональной активности Fas-системы вызывает гиперплазию и лимфопролиферацию У пациентов накапливаются лимфоциты, несущие гетерозиготные мутации в гене Fas, не являющиеся канцерогенными. Отклонение от нормы в выживании лимфоцитов может позволить клеткам накапливать мутации, приводящие к злокачественности.
2. TRAIL трансмембранный белок. TNFSF10, или TRAIL (от англ. Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10; TNF-related apoptosis-inducing ligand) — цитокин семейства факторов некроза опухоли, лиганд, вызывающий апоптоз. В результате расщепления протеазами внеклеточный домен TRAIL высвобождается из клетки. Рекомбинантный растворимый TRAIL способен вызывать апоптоз в клетках из широкого спектра человеческих опухолей, не затрагивая нормальные клетки.
3. CD30 (Ki-1) - трансмембранный белок. Взаимодействие цитокинового рецептора CD30 со своим лигандом обладает биологическими эффектами, такими как: дифференцировка, активация, пролиферация и клеточная гибель. CD30 передает информа-цию, необходимую для иммунного ответа.
4. CD40L - ко-стимулятор пролиферации Т-клеток, экспрессируется активированными Т-клетками. Взаимодействие CD40-CD40L играет центральную роль на различных фазах В-клеточного ответа на Т-зависимые антигены.
5. Цитокин TWEAK является трансмембранным белком. Осуществляет передачу сигнала с использованием нескольких различных TNFR-ассоциированных факторов. Осуществляет стимуляцию роста клеток и ангиогенез, индукцию воспалительных цитокинов, а при некоторых экспериментальных условиях стимулирует апоптоз.
2. Характеристика рецепторов к сигналам апоптоза1. Растворимый FAS (sFas) FAS, также называемый CD95 или APO-1, относится к классу рецепторов TNF/NGF Fas-опосредованный путь апоптоза. Инициаторная фаза апоптоза может осуществляться опосредовано через «рецепторы смерти». Для его развития необходимо взаимодействие Fas-рецептора, презентированного на мембране Fas-позитивных клеток, и Fas-лиганда.
2. DR95 (Death Receptor) «Рецепторы смерти» (DR) СD95-рецепторно-лигандная система принимает непосредственное участие в апоптозе, индуцированном через CD3 Т-клеточный рецептор антигена. CD95-лиганд вовлечен в цитотоксическое действие Т-лимфоцитов. Цитотоксические Т-лимфоциты убивают клетки-мишени поляризуя гранулы, содержащие перфорины или гранзимы, вызывающие клеточную смерть через повреждение мембраны или ДНК.
3. Характеристика регуляторов апоптоза1. Bcl-2 Регулятор апоптоза Bcl-2 (англ. Apoptosis regulator Bcl-2) — внутриклеточный белковый фактор, основной представитель семейства Bcl-2. Подавляет апоптоз во многих клеточных системах, включая лимфогематопоэтические и нейрональные клетки. Регулирует клеточную смерть, контролируя проницаемость митохондриальной мембраны. Ингибирует каспазы за счёт предотвращения выхода цитохрома c из митохондрий и/или за счёт связывания фактора, активирующего апоптоз — APAF1.
2. Белок р53 является продуктом гена-супрессора опухоли р53 и экспрессируется во всех клетках организма. р53 — фактор, который запускает транскрипцию группы генов и который активируется при накоплении повреждений ДНК. Результатом активации р53 является остановка клеточного цикла и репликации ДНК; при сильном стрессовом сигнале — запуск апоптоза. Белок р53 активируется при повреждениях генетического аппарата, а также при стимулах, которые могут привести к подобным повреждениям, или являются сигналом о неблагоприятном состоянии клетки (стрессовом состоянии). Функция белка р53 состоит в удалении из пула реплицирующихся клеток тех клеток, которые являются потенциально онкогенными (отсюда образное название белка р53 — англ. guardian of the genome — хранитель генома).
3. Семейство каспаз. Эффекторное звено апоптозного пути представлено семейством внутриклеточных протеаз, называемых каспазами. Они присутствуют во всех клетках, где расщепляют белки. К настоящему времени у человека идентифицировано 14 каспаз, которые по своимфункциональным особенностям делятся на активаторы цитокинов (1, 4, 5, 13), инициаторные (8 и 10) иэффекторные (в основном, 3, 6 и 7). Каспаза-9 служит медиатором митохондриального пути апоптозного сигналинга. Каспазы находятся в клетках в неактивномсостоянии (прокаспазы). Активация каспаз происходит путем их протеолитического расщепления в мес-тах расположения аспарагиновых оснований. После выхода в цитозоль цитохром С связывается с адапторной молекулой Apaf-1, активирующей прокаспазу-9 Данный комплекс называется апоптосомой. Каспаза-9,в свою очередь активирует каспазы-3 и -7, что приводит к фрагментации ДНК и апоптозу. К ингибиторам эффекторных каспаз относятсябелки семейства IAP, подавляющие активность кас-паз-3 и -9.
4. Белки теплового шока (HSP). HSP оказывают антиапоптотическое действие, подобно белку bcl-2. sHsp могут влиять на функционирование и передачу сигнала отрецептора Fas/Apo-1 внутрь клетки, во-вторых, они могут тем или иным способом влиять на выход цитохрома С из митохондрий и, наконец, в-третьих, эти белки могут влиять на формирование апоптосом иактивацию каскада каспаз.

Приложенные файлы

  • docx 18395596
    Размер файла: 161 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий