Immunokhromatograficheskiy_metod_studentam

ВВЕДЕНИЕ
В современной мировой медицинской и ветеринарной практике лабораторная диагностика патологий занимает приоритетные позиции, как основной инструмент постановки диагноза и мониторинга болезней. Одним из значимых и востребованных тестов является иммунохроматографический анализ.
Иммунохроматографический анализ (ИХА) - это метод определения наличия низких концентраций веществ в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, фекалии и т. д.). Данный вид анализа (экспресс-тест) осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования.
Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тест позволяет визуально в течение нескольких минут определить и оценить содержание антигенов, антител, гормонов и других диагностически важных веществ в организме животных и человека. Экспресс-тесты отличаются высокой степенью чувствительности и специфичности, обнаруживая более 100 видов заболеваний, включая такие распространённые болезни, как туберкулёз, парвовирусный энтерит, панлейкопения кошек, хламидиоз, различные виды вирусных гепатитов, и др., а также всю гамму применяемых наркотических веществ с высокой достоверностью определения. Важным преимуществом данного вида тестов является их применение в диагностике in vitro, не требующей непосредственного присутствия обследуемого больного и возможность работы в полевых условиях.
В последнее время в Республике Беларусь ИХА получает все большее распространение, поскольку данный метод позволяет обнаруживать заболевания на ранней стадии, тем самым предотвращая их развитие, что имеет важное значение в борьбе с различными заболеваниями животных.
В настоящем учебно-методическом пособии представлены теоретические данные по ИХА, схема работы метода, критерии, на основании которых оценивают результаты исследований.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
НАЗВАНИЕ (СИНОНИМЫ)
Иммунохроматографический анализ (ИХА) – высокочувствительный и высокоспецифичный экспресс-тест для диагностики заразных и незаразных болезней. ИХА – сравнительно молодой метод анализа, он часто обозначается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс-тест или экспресс-анализ.
2. НАЗНАЧЕНИЕ
Метод предназначен для определения антигенов в исследуемом материале и специфических антител в сыворотках крови животных и человека.
В настоящее время ИХА широко применяется на практике для диагностики гриппа сельскохозяйственных животных и птиц, инфекционных болезней плотоядных (парвовирусный энтерит собак, панлейкопения кошек, вирусный энтерит норок, иммунодефицит кошек), ротавирусной инфекции, болезни Ауески и других болезней.
Работа возможна с различным биоматериалом. К такому материалу относятся цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, моча, фекалии.
3. СУЩНОСТЬ
Данный метод является сочетанием серологического метода исследования с распределительной хроматографией. Хроматография (от греч. chroma – цвет, краска, grapho – пишу) – метод разделения, анализа и исследования веществ. Существует несколько разновидностей хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная, аффинная. Открыта в 1903 г русским учёным М.С. Цветом. Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рисунок 1). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол-уксусная кислота-вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.












Рисунок 1 – Принципиальная схема распределительной хроматографии (хроматограмма) на бумаге с разделенными и окрашенными веществами: 1 – фронт растворителя, 2 – разделенные вещества, 3 – место нанесения образца












Рисунок 2 – Тест-полоска: вид сверху и вид в разрезе



Если в исследуемом материале содержится специфический антиген, то при нанесении его на хроматографическую мембрану (иммунострип) образуется комплекс антиген-антитело с соответствующим конъюгатом в составе иммунострипа, который по капиллярам мигрирует в зону Т и взаимодействует с вторичными антителами, образуя зону окрашивания.
4. КОМПОНЕНТЫ
исследуемый антиген;
конъюгат моноклональных антител, специфичных к исследуемому антигену, с красителем (коллоидным золотом), мигрирующим вдоль полоски вместе с физиологической жидкостью;
поликлональные иммуноглобулины, специфичные к исследуемому антигену, жестко иммобилизованные на тест-полоске;
вторичные иммуноглобулины к моноклональным антителам специфичные к антителам с красителем, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.
Моноклональные антитела (Monoclonal antibodies) - гомогенные антитела, продуцируемые гибридными клетками, в которых сочетаются способность синтеза специфических иммуноглобулинов одного изотипа с неограниченной пролиферацией. Методику получения таких гибридных клеток, иначе называемых гибридомами (hybridomas), разработали Дж. Кёлер и К. Мильстайн в 1975 году, которая состоит в том, что лимфоциты иммунизированного животного, например, мыши, гибридизуются с культивируемыми в среде опухолевыми клетками (например, мышиными миелобластами). В процессе пассажей гибридом удается проводить отбор клонов, синтезирующих антитела с интересующей исследователя специфичностью.
Главным преимуществом моноклональных антител является именно стандартная и воспроизводимая в пассажах специфичность в отношении конкретного [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], поскольку каждый из отобранных клонов содержит генный набор одного иммунного лимфоцита, тогда как обычные сыворотки от иммунизированных животных представляют собой смесь сходных, но не идентичных антител, продуцируемых множеством лимфоцитов. Эти антитела, в отличие от моноклональных, обозначаются как поликлональные. Моноклональные антитела однородны не только по своей специфичности, но и по всем другим биологическим свойствам: авидности, стабильности, аффинности и т. п. Гибридомная технология позволяет изготавливать практически неограниченные количества гомогенных антител к разнообразным антигенам, т. е. препаратов диагностического, производственного или лечебного назначения.
Моноклональные антитела нашли широкое применение в вирусологической практике и экспериментальной вирусологии. С их помощью стало возможным повысить чувствительность и воспроизводимость диагностических тестов. В то же время требуется известная осмотрительность при использовании моноклональных антител для обнаружения и идентификации вирусов: из-за своей высокой специфичности эти антитела могут не распознать тот или иной природный изолят вируса, если в результате мутации строение эпитопа, ответственного за связь с данным антителом, изменилось. Особую ценность представляет способность моноклональных антител дифференцировать антигенные варианты вируса внутри одного серотипа, например, “дикие” и вакцинные полиовирусы.
В генной инженерии моноклональные антитела успешно используются для выявления протективных эпитопов в составе рекомбинантных иммуногенов. Моноклональные антитела, фиксированные на водонерастворимом полимере, служат хорошим средством хроматографической очистки и выделения из смеси как вирусных антигенов, в том числе и поверхностного антигена вируса гепатита В, так и разнообразных биологически активных веществ, например, интерферонов.

КАЖДЫЙ НАБОР СОДЕРЖИТ:
Тест-кассету с пластиковой пипеткой (или тест-полоску) индивидуально упакованную в пакет из фольги, снабженную средством, поддерживающим сухость;
Бутылочку-капельницу с растворителем;
Инструкцию по применению.
На рисунке 3 представлена тест-система BIOLINE Influenza Antigen для выявления антигенов вируса гриппа типов А и В.

МАТЕРИАЛ
ЦЕЛЬНАЯ КРОВЬ:
Сбор цельной крови осуществляется в соответствии с общепринятыми клиническими лабораторными правилами;
Для сбора цельной крови необходимо использовать капиллярные тюбики с гепарином, обработанные антикоагулянтом;
Образцы цельной крови необходимо тестировать сразу после ее сбора.

Рисунок 3 – Тест-система BIOLINE Influenza Antigen для выявления антигенов вируса гриппа типов А и В. Производитель: Standard Diagnostic, Inc., Республика Корея
СЫВОРОТКА И ПЛАЗМА: Сбор сыворотки и плазмы осуществляется в соответствии с общепринятыми клиническими лабораторными правилами.

5. ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ
При погружении тест-полоски в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с жидкостью двигаются антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген, то происходит его связывание как с первым, так и со вторым типом антител. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой (чаще красной или коричневой) полосы. Не связавшиеся с красителем антитела мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют с вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая полоса. Взаимодействие (и образование полосы) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости (рисунки 4, 5).














Рисунок 5 – Отрицательный результат: появление только одной темной полосы в контрольной зоне

13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415

Рисунок 4 – Положительный результат: появление двух темных полос в тест-зоне (Т) и контрольной зоне (К)

6. УЧЁТ РЕАКЦИИ
Учет реакции проводится визуально, оценивается наличие полос в тест-зоне и контрольной зоне по истечении 5 – 20 минут (рисунки 6, 7).
Существуют следующие варианты результатов тестирования:
1) две полосы - положительный результат;
2) одна полоса - отрицательный результат;
3) нет полос - анализ проведен неправильно.



Рисунок 6 – Рабочий иммунострип корейской фирмы Antigen для идентификации антигенов вируса гриппа с проявленной контрольной полосой (отрицательный результат)




Рисунок 7 – Рабочий иммунострип корейской фирмы Anigen для идентификации антигенов вируса гриппа с проявленной тестовой и контрольной полосой (положительный результат).

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ
ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Чтобы оценить тяжесть патологии, важен количественный результат – концентрация тестируемого вещества. Именно для этого и разработаны специальные «количественные» тестовые кассеты и ридеры для них (рисунок 8). Эти компактные и точные приборы можно разместить везде, где есть электричество.

Рисунок 8 – Ридер для количественных экспресс-тестов. Размеры 20Ч20Ч7 см

Один из мировых лидеров в разработке иммунохроматографической экспресс-диагностики – французская компания VEDALAB. Разработанные этой фирмой количественные тестовые кассеты и ридеры определяют постепенное увеличение интенсивности окраски в диапазоне от нулевой до максимальной, пропорционально концентрации антигена.
У этих кассет нет фиксированного пограничного (cut off) уровня, характеризующего концентрацию, выше которой начинается патология. Но ридер сканирует эти кассеты, запоминает показания и введенную информацию и на каждую пробу выдает чек.
Использование таких количественных кассет и ридеров позволяет за 15-20 минут получить количественную характеристику степени тяжести патологии. Например, количественный экспресс-тест на так называемый D-Димер, оценивающий работу системы гемостаза.

7. ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ
ПРЕИМУЩЕСТВА
Быстрое выявление антигена в исследуемой пробе.
Не требуются наборы и процедуры специальной лабораторной техники: нагревания, фильтрования, экстракции с точным разделением слоев жидкости, центрифугирования и др.
Тесты состоят из заранее приготовленных реагентов, сохраняющих свои свойства в течение длительного времени и в широком диапазоне климатических условий.
Проведение тестов лицами без специальной химической подготовки и специальных защитных приспособлений (защитная одежда, очки, перчатки и др.).
Чувствительность химических методов анализа составляет 10-5 – 10-7 граммов вещества (до нескольких нанограмм (10 – 50 нг) на мл объекта.
Тесты функционируют только при физиологических или очень близких к ним условиях, таких как значение рН, температура, отсутствие сильных окислителей или восстановителей, определенная ионная сила среды и др.
НЕДОСТАТКИ: сложности в получении моноклональных антител и получении конъюгатов.
ЛИТЕРАТУРА
Березов, Т.Т. Биологическая химия : учебник для студентов медицинских вузов / Т.Т.Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. : Медицина, 2004. – 704 с.
Биотехнология. Принципы и применение / под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джойса. – М. : Мир, 1988. – 415 с.
Егорова, Т.А. Основы биотехнологии : учебное пособие для высших педагогических учебных заведений / Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина. – 4 изд., - М. : Издательский центр «Академия», 2008. – 208 с.
Иммунология : в 3-х томах / под ред. У. Поля. – М. : Мир, 1987. – 3 т.
Иммунология : учебное пособие / П.А. Красочко [и др.] ; под ред. П.А. Красочко, Н.Д. Лисова. – Минск : Аверсев, 2005. – 128 с.
Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / под ред. А.А. Воробьева. – М. : Медицинское информационное агентство, 2004. – 367 с.
Новиков, Д.И. Медицинская иммунология / Д.И. Новиков. – Минск : Вышэйшая школа, 2005. – 296 с.
Павлович, С.А. Микробиология с вирусологией и иммунологией / С.А. Павлович. – Минск : Вышэйшая школа, 2005. – 799 с.
Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. – М. : Мир, 2000. – 895 с.
Ярилин, А.А. Основы иммунологии : учебник / А.А. Ярилин. – М. : Медицина, 1999. – 908 с.
Abe, C., Hirano, K., Tomiyama, T. Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti-MPB64 monoclonal antibodies. J.Clin.Microbiol. – 2004. – Vol. 37. – P. 3693 – 3697.
Demmler, A.C. Comparison of a new lateral-flow chromatographic membrane immunoassay to viral culture for rapid detection and differentiation of influenza A and B viruses in respiratory specimens / A.C. Demmler [et al.] // J. of Clin. Microbiology. – 2004. – Vol. 42. - № 8. – P. 3661–3664.
Mandell, G.L. In Mandell, Douglas and Bennett's Principles and Practice of infectious Diseases / G.L. Mandell, E. Bennett, P. Dolin // Churchill Livingston New York, 1995. – 497 р.















13PAGE 15





13PAGE 15


13PAGE 14515




1

2

3



Рисунок 6

Заголовок 1 Заголовок 2 Заголовок 3 Заголовок 515

Приложенные файлы

  • doc 18362696
    Размер файла: 828 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий