kurs_molodogo_bojca


Чтобы хорошо написать КСР, нужно подготовить следующие теоретические вопросы:
1) Принципы конструирования векторов на основе плазмид E.coli
2) Принципы конструирования векторов на основе фагов (λ и нитевидных)
3) Принципы конструирования гибридных векторов
4) Принципы конструирования векторов на основе Ti-плазмид
5) Принципы конструирования векторов на основе ретровирусов
Информацию можно почерпнуть из учебников Рыбчина, Глика и Пастернака, Щелкунова. Все они есть в свободном доступе в Интернете. Если не найдете, звоните – пришлю.
Также необходимо знать определения основных понятий из курса Векторные ситемы.
И самое главное – уметь производить рестрикцию, модификацию концов, лигирование и построение праймеров.
Рестрикция
Надеюсь, что определить, какие концы выступают, все в состоянии. ДНК всегда записывается от 5 к 3-концу. Куда ближе стрелочка, тот конец и выступает. Соответственно, если стрелочка посередине, то образуются ровные концы.
Чтобы потренироваться, запишите двухцепочечные сайты рестрикции для следующих рестриктаз:
BbeI - GGCGC^C
RsrII - CG^GWCCG (для непонятных букв можно писать как комплементарное основание N)
MscI - TGG^CCA
Записали? Теперь определите, какие концы выступают. Сколько нуклеотидов образуют липкие концы? С помощью каких ферментов выступающие концы можно сделать ровными?
Получилось? Отлично
А как вам такой сайт рестрикции?
R1 – GGGCCA(10/12)
Что бы это могло значить?
Данная рестриктаза режет на определенном расстоянии от сайта узнавания. Если записать двухцепочечный сайт, который образуется после рестрикции, то получится так:
GGGCCANNNNNNNNNNC CCGGTNNNNNNNNNNNN
Какие концы соответственно образуются? Правильно, липкие. И сколько нуклеотидов выступает. Конечно же, 2. А чем тупить будем?
Лигирование
Со сшиванием двух молекул после рестрикции мы, вроде, разобрались, но всё же позволю себе напомнить. Возьмем уже знакомые нам рестриктазы BbeI (GGCGC^C) и MscI (TGG^CCA). Допустим, что одну молекулу ДНК мы обработали BbeI, а потом сделали концы ровными с помощью… правильно, Т4 ДНК-полимеразы, ведь здесь 3-концы выступают. А вторую молекулу обработали MscI, образовались ровные концы. Теперь лигируем. Что получилось?
GCCACGGT
Или
TGGCACCG
(Черные буквы от сайта MscI, красные – то, что осталось от сайта BbeI после порезки и обработки Т4 ДНК-полимеразой)
А если вместо BbeI возьмем рестриктазу NheI (G^CTAGC). Чем будем делать концы ровными? Неужели фрагментом Клёнова? И что получим после лигирования?
TGGCTAGCACCGATCG
Или
GCTAGCCACGATCGGT
Понятно? Если непонятно, приходите в гости, объясню еще раз.
Строим праймеры
В программе-то все понятно: кнопочку нажали – последовательность перевернулась. А на КСРе что делать будем?
Вот есть у нас последовательность:
ATTGGATTTCCCCATGCCCATCCCATGGGATG
Нужно праймеры к ней построить 5-членные (5-нуклеотидные)
Допустим, с прямым праймером всё понятно: берем 5 первых нуклеотидов и просто в наглую переписываем. Вот и праймер: ATTGG. Ура!
А с обратным все гораздо сложнее. Откуда же его взять? Он должен быть уже комплементарен нашей цепи. Праймер к началу у нас есть. Теперь нас интересует конец. Пишем компелентарную цепь.
5-ATTGGATT TC C CCATGCCCATC C CATGGGATG-33-TAACCTAAAGGGGTACGGGTAGGGTAC C C TAC-5
Жирный красный – это и есть наш праймер. А теперь нам нужно обратный праймер записать в последовательности от 5- к 3-концу. Пишем: CATCCC. Я понятно объясняю? Если непонятно, жду на чай.
Если перед вами стоит задача рассчитать режимы ПЦР, то нужно написать все этапы. Предварительно необходимо определить температуру отжига праймеров. Не забывайте, что если праймеры с навесками, то навески в расчет температуры не идут по тоц простой причине, что нет для них комплементарной последовательности, где бы они могли отжечься. Поэтому, сначала «снимаем» навеску, а потом считаем температуру отжига по формуле:
(a+t)*2 + (c+g)*4 = Tm
Когда указываете режимы ПЦР, не забудьте от этого значения отнять 5.
Желаю успехов в подготовке и счастья в личной жизни!
Ничего не бойтесь, будет страшно, но недолго
М.И.

Приложенные файлы

  • docx 18356711
    Размер файла: 16 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий