kult_klet_1


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
КЛЕТОК
5
Культивирование
микроорганизмов
Основные источники
получения микроорганизмов,
используемых для культивирования.
1.
Классический
путь

проводится
выделение
микроорганизмов
из
мест,
где
обитание
того
или
иного
вида
наиболее
вероятно
.
В
элективных
средах
путем
варьирования
различных
Дакторов
создаются
избирательные
условия
для
преимущественного
развития
определенного
микроорганизма
.
Таким
образом
получают
накопительные
культуры
микроорганизмов
.
Следующий
этап

выделение
чистых
культур
.
Для
этого
используют
плотные
питательные
среды,
на
которые
засевают
образцы
проб
из
накопительных
культур
.
Отдельные
клетки
микроорганизмов
на
плотных
питательных
средах
образуют
изолированные
колонии,
при
их
последующем
пересеве
получаются
чистые
культуры
продуцента
.
2
.
Другой
путь
подбора
микроорганизмов

из
имеющихся
коллекций
микроорганизмов
.
Получение накопительных культур
Выделение
чистой
культуры
данного
микроорганизма
будет
успешным,
если
он
присутствует
в
смешанной
популяции
в
достаточно
высокой
концентрации,
т
.
е
.
количественно
преобладает
.
Разработанные
методы
накопления
имеют
целью
добиться
увеличения
относительного
количества
данного
организма
благодаря
созданию
лучших
условий
для
его
роста
и
выживания
по
сравнению
с
другими
или
путем
пространственного
отделения
его
от
других
членов
популяции
.
К
Дизическим
методам
накопления
следует
относить
регуляцию
роста
температурой,
тепловую
и
ультразвуковую
обработку,
ультраДиолетовое
облучение,
приводящие
к
гибели
или
подавлению
роста
других
организмов,
присутствующих
в
популяции,
но
существенно
не
затрагивающие
выделяемые
клетки
.

Можно
также
использовать
преимущества
в
некоторых
Дизических
свойствах
изучаемого
микроорганизма,
таких,
как
его
размеры
и
подвижность
;
это
позволяет
в
значительной
мере
отделить
данный
организм
от
других
в
популяции
.

В
основе
действия
химических
методов
лежит
использование
токсичных
веществ,
которые
подавляют
рост
оставшейся
части
популяции,
не
оказывая
влияния
на
выделяемый
микроорганизм
.
Кроме
того,
это
могут
быть
вещества,
служащие
источниками
питания,
используемыми
преимущественно
отдельными
микроорганизмами
в
смешанной
популяции
.

Биологические
методы
включают
использование
специДических
хозяев
для
выделяемого
организма,
а
также
преимуществ
некоторых
патогенных
свойств
микроорганизма
(например,
его
инвазивность),
которыми
не
обладают
другие
представители
популяции
.
Во
многих
случаях
для
получения
максимального
эДДекта
накопления
сочетают
Дизические,
химические
и
биологические
методы
.

Как
правило,
накопительные
культуры
получают
в
закрытых
системах,
т
.
е
.
микроорганизмы
выращивают
в
обычных
периодических
(стационарных)
условиях
на
чашках
Петри,
в
колбах
или
пробирках,
где
в
среде
культивирования
концентрация
питательных
веществ
и
продуктов
метаболизма
постоянно
изменяется
в
процессе
роста
клеток
.
Получение чистых культур

Из
накопительных
культур
микроорганизмы
обычно
выделяют
путем
их
пространственного
отделения
от
других
Дорм
на
твердой
среде,
где
они
растут
в
виде
колоний
.
Для
микроорганизмов,
не
растущих
на
твердых
средах,
можно
использовать
метод
предельного
разведения,
последовательно
перенося
клетки
в
отдельные
пробирки
с
жидкой
средой
.

Для
выделения
микроорганизмов
в
виде
чистых
культур
известно
сравнительно
мало
методов
.
Чаще
всего
используют
способ
изолирования
отдельных
клеток
на
твердой
питательной
среде
или
метод
предельных
разведений
.

Однако
получение
отдельной
колонии
не
всегда
гарантирует
чистоту
культуры,
поскольку
колонии
могут
вырасти
не
только
из
отдельных
клеток,
но
из
их
скоплений
.

Для
выделения
предпочтительнее
использовать
неселективную
среду,
поскольку
на
ней
лучше
растут
контаминирующие
микроорганизмы
и
их
легче
обнаружить
.
Не
следует
очень
быстро
отбирать
колонии,
поскольку
за
данный
отрезок
времени
могут
не
вырасти
медленно
растущие
контаминирующие
организмы
.
Чистые культуры
Из
чистой
культуры
обычно
вырастают
одинаковые
колонии,
и
при
микроскопировании
выявляются
схожие
клетки,
в
частности,
по
морДологии
и
результатам
окраски
по
методу
К
.
Грама
.
Однако
возможны
исключения,
например,
колонии,
вырастающие
из
чистой
культуры,
могут
быть
гладкие
(S)
и
шероховатые
(Р)
.
Кроме
того,
в
чистых
культурах
различных
микроорганизмов
могут
появиться
морДологически
различные
клетки
(
полиморДизм
),
цисты
и
споры
.
Наконец,
некоторые
микроорганизмы
проявляют
грамвариабельность
.
Тем
не
менее,
указанные
критерии
широко
используются
при
определении
чистоты
культур
.
Определение чистоты культуры

При
определении
чистоты
культуры
учитывают
морДологию
колоний,
Дормирующихся
на
плотных
питательных
средах,
оценивая
следующие
признаки
:


проДиль

плоский,
выпуклый,
кратерообразный,
конусовидный
и
т
.
д
.;


Дорму

округлая,
амебовидная,
неправильная,
ризоидная
и
т
.
д
.;


размер
(диаметр)

измеряют
в
миллиметрах
;
если
размеры
колонии
не
превышают
1
мм,
то
их
называют
точечными
;


поверхность

гладкая,
шероховатая,
бороздчатая,
складчатая,
морщинистая,
с
концентрическими
кругами
или
радиально
исчерченная
;


блеск
и
прозрачность

колония
блестящая,
матовая,
тусклая,
мучнистая,
прозрачная
;


цвет

бесцветная
(грязно
-
белые
колонии
относят
к
бесцветным)
или
пигментированная
;
особо
отмечают
выделение
в
субстрат
пигмента
;



край

ровный,
волнистый,
зубчатый,
лопастной,
ризоидный,
бахромчатый
и
т
.
д
.;


структуру

однородная,
мелко
-
или
крупнозернистая,
струйчатая
и
т
.
д
.;


консистенцию
:
колония
может
легко
сниматься
с
агара,
быть
плотной,
мягкой
или
врастающей
в
агар,
маслянистой,
слизистой
(прилипает
к
петле),
вязкой,
пленчатой
(снимается
целиком),
быть
хрупкой
(легко
ломается
при
прикосновении
петлей)
.


Размеры
и
многие
другие
особенности
колонии
могут
изменяться
с
возрастом
и
зависят
от
состава
среды
.
Поэтому
при
их
описании
указывают
возраст
культуры,
состав
среды
и
температуру
культивирования
.
Рис. Форма колонии
1

круглая;
2

круглая с Дестончатым краем;
3

круглая с
валиком по краю;
4, 5

ризоидные;
6

с ризоидным краем;
7

амебовидная;
8

нитевидная;
9

складчатая;
10

неправильная;
11

концентрическая;
12

сложная
Рис. ПроДиль колонии
1

изогнутый;
2

кратерообразный;
3

бугристый;
4

врастающий в субстрат;
5

плоский;
6

выпуклый;
7

каплевидный;
8

конусовидный
Рис. Край колонии
1

гладкий;
2

волнистый;
3

зубчатый;
4

лопастной;
5

неправильный;
6

реснитчатый;
7

нитчатый;
8

ворсинчатый;
9

ветвистый
Рис. Структура колонии
1

однородная;
2

мелкозернистая;
3

крупнозернистая;
4

струйчатая;
5

волокнистая
Рис.
Колонии дрожжей разных видов на сусло
-
агаре
Haemophilus influenzae

Рис. Культура дрожжевого гриба
Candida albicans
Рис. Колонии
мицелиальных грибов
КлассиДикация процессов культивирования

Выбор
процесса
культивирования
зависит
не
только
от
потребностей
организма,
но
и
от
того,
для
чего
будет
использована
культура,
то
есть,
от
конечной
цели
эксперимента
.

1
)
по
состоянию
питательной
среды
или
по
основной
Дазе
(поверхностные
и
глубинные)
;

2
)
по
наличию
или
отсутствию
перемешивания
(динамические
или
статические)
;

3
)
по
содержанию
кислорода
(на
аэробные
или
анаэробные)
;

4
)
по
способу
действия
(закрытые,
чаще
периодические,
и
открытые,
чаще
непрерывные)
;

5
)
по
количеству
Дерментеров
(одно
-
,
дву
-
и
многостадийные)
;

6
)
по
способу
управления
(хемостатные,
турбидостатные,
оксистатные,
рН
-
статные
и
другие)
;

7
)
по
степени
защищенности
от
посторонней
микроДлоры
;

8
)
по
числу
видов
микроорганизмов
.
Рис. Основные методы культивирования микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов
на твердой поверхности

Культура
бактерий
на
твердой
среде
имеет
ряд
преимуществ
:

1
.
В
случае
культур,
выращенных
на
твердой
среде,
нет
необходимости
использовать
оборудование
для
сбора
клеток,
поскольку
в
этих
культурах
клетки
находятся
уже
в
сконцентрированном
состоянии
.

2
.
Твердые
культуры
относительно
свободны
от
макромолекулярных
компонентов
и
полностью
свободны
от
частиц
питательной
среды,
так
как
последние
обычно
находятся
внутри
агарового
геля
.
Более
того,
твердые
культуры
относительно
свободны
от
низкомолекулярных
питательных
веществ
и
продуктов
метаболизма
микроорганизмов
.

3
.
На
твердых
средах
можно
получать
результаты,
которые
невозможно
достичь
другим
путем
.
Недостатки твердых культур

1
.
Твердая
культура
имеет
ограничения
при
выращивании
больших
количеств
биомассы
.

2
.
Твердые
культуры
не
обеспечивают
однородность
популяции
клеток,
т
.
е
.
культура
гетерогенна
в
Дизиологическом
отношении
.
Гетерогенна
культура
и
в
техническом
смысле,
так
как
клетки
микроорганизмов
и
питательная
среда
распределены
неравномерно
.

3
.
Твердые
культуры
характеризуются
небольшим
числом
клеток
в
пересчете
на
данное
количество
среды
.
ТвердоДазное культивирование
Используется
в
основном
для
культивирования
грибов
.
В
качестве
твердой
Дазы
могут
выступать
различные
виды
растительного
сырья
.
1.
Дешевое
производство
и
возможность
использования
субстратов,
которые
непригодны
для
других
способов
культивирования
.
2.
Некоторые
процессы
протекают
значительно
интенсивнее
.
Варианты
твердоДазного
культивирования
:
1
.
Поверхностное
(«тонкий
слой»),
2
.
Глубинное
в
неперемешиваемом
слое
(«высокий
слой»),
3
.
Культивирование
в
перемешиваемой
и
аэрируемой
массе
.

Преимуществами
такого
способа
культивирования
являются
простота
конструкций
биореакторов
(растильных,
или
бродильных,
камер),
систем
подачи
воздуха
и
регулирования
температурно
-
влажностного
режима
.

К
недостатком
относят
низкую
эДДективность
использования
субстрата
и
продуктивность
;
сложность
механизации
и
автоматизации
процесса
культивирования,
стерилизации,
загрузки
-
разгрузки
лотков
и
кювет
;
нестерильность
процесса
.

Рис. Аппарат Шуценбаха:

1

деревянная коническая ѐмкость;

2

слой буковых стружек

Рис
.
2
.
Аппарат
Фрингса
:
1

корпус
;
2

ложное
перДорированное
днище
;
3

слой
буковых
стружек
;
4

циркуляционный
насос
;
5

змеевик
системы
термостатирования
;
6

распределительное
устройство
стружек
.
Дерментѐры для
производства уксуса

В
поверхностных
твердоДазных
процессах
роль
биореакторов
выполняют
большие,
площадью
до
нескольких
кв
.
метров,
лотки
(
или
подносы
)
из
алюминия
или
культивационные
камеры
.
При
твердоДазной
Дерментации
процесс
протекает
в
вентилируемых
растильных
(
бродильных)
камерах
с
регулируемым
температурно
-
влажностным
режимом,
в
которых
на
стеллажах
размещают
лотки
с
твердой
средой
.
Для
лучшей
аэрации
среды
подаваемый
в
камеру
воздух
проходит
через
перДорированное
днище
лотков
.

В
большинстве
твердоДазных
процессов
отсутствует
перемешивание,
рост
микроорганизмов
происходит
по
принципу
колонизации
:
по
мере
размножения
они
распространяются
из
точек
внесения
в
субстрат
по
всему
его
объему
.
При
этом
отдельные
зоны
в
толще
субстрата
избыточно
населяются
клетками
и
возникает
локальная
нехватка
питательных
ресурсов,
значительная
же
часть
субстрата
остается
незатронутой
.
ТвердоДазный биореактор
Субстрат
с
посевным
материалом
размещают
на
модульных
основаниях
и
пропускают
увлажненный
воздух
.
ЖидкоДазное поверхностное
культивирование

Поверхностные
жидкоДазные
процессы
в
биотехнологических
производствах
используют
для
культивирования
мицелиальных
грибов
при
получении
органических
кислот,
Дерментных
препаратов,
кормовой
биомассы
.
Для
этих
целей
применяется
кюветный
способ
культивирования
.
Среда
загружается
в
стерильные
кюветы,
размещаемые
на
открытых
стеллажах
в
растильных
камерах
с
регулируемым
температурно
-
влажностным
режимом
.
Вентиляцию
помещений
осуществляют
очищенным
стерильным
воздухом,
который
одновременно
выполняет
Дункцию
теплового
агента
.

Микроорганизмы
растут
в
виде
пленки
биомассы
на
поверхности
жидкой
питательной
среды
.

После
завершения
процесса
культуральная
жидкость
сливается
из
кювет
через
вмонтированные
в
днища
штуцеры
и
поступает
на
обработку
.
Процессы суспензионного или глубинного
культивирования
Простейшая классиДикация процессов суспензионного или
глубинного культивирования:
1)
периодическое культивирование;
2)
продленное оптимизированное периодическое
культивирование с подпиткой или без нее;
3)
многоциклическое культивирование;
4)
полунепрерывное культивирование;
5)
непрерывно
-
синхронное культивирование;
6) непрерывное культивирование.
Периодическое культивирование
Периодический
метод
культивирования
предусматривает
внесение
посевного
материала
в
питательную
среду
(инокуляция
клетками
среды)
в
начале
процесса
и
получение
культуры
по
достижении
заданной
Дазы
развития
популяции
.
Концентрация
микроорганизмов
в
периодической
культуре
нарастает
и
останавливается
либо
из
-
за
лимитирования
субстратом,
либо
из
-
за
ингибирования
токсичными
продуктами
жизнедеятельности
.
Практически
все
системы
периодического
культивирования
являются
закрытыми,
поскольку
микроорганизмы
в
них
размножаются
и
проходят
все
Дазы
развития
без
притока
питательной
среды
и
оттока
культуральной
жидкости
.
При изучении динамики роста культур микроорганизмов
необходимо строго соблюдать некоторые условия:
1)
жизнеспособность засева;
2) наличие в среде культивирования всех необходимых
питательных веществ;
3)отсутствие в среде ингибиторов, подавляющих рост клеток;
4) поддержание в среде оптимальными всех Дизико
-
химических
условий.
Рис. Основные Дазы кривой роста
периодической культуры микроорганизмов
Параметры кривой роста
Под
урожаем
клеток
(
Х
)
понимают
разность
между
максимальной
и
исходной
массой
бактерий
:
X = X
aх

Х
о
.
Особенно
важно
отношение
урожая
клеток
к
количеству
потребленного
субстрата
(
X/S
)
.
Если
обе
эти
величины
выражают
в
весовых
единицах,
то
отношение
Х/S,
называемое
экономическим
коэДДициентом
,
обозначают
через
Y
:
Y
=
d
Х/
dS
,
где
dX

увеличение
биомассы,
соответствующее
потреблению
субстрата
в
количестве
dS
.
Важность
экономического
коэДДициента
состоит
в
том,
что
он
выражает
количественные
потребности
организма
в
пище
.

Если
же
урожай

граммах)
относят
к
числу
молей
потребленного
субстрата,
то
экономический
коэДДициент,
называемый
в
этом
случае
молярным
экономическим
коэДДи
ц
иентом
,
обозначают
через
У
m
.

Молярный
экономический
коэДДициент
позволяет
связать
урожай
клеток
с
полученным
из
какого
-
либо
источника
энергии

.
е
.
какого
-
либо
субстрата)
количеством
АТФ
.
У
АТФ
-
энергетический
коэДДициент
,
выражается
в
граммах
клеточной
массы
на
1
моль
АТФ
.
Скорость
потребления
субстрата
культурой
в
данный
момент
времени
выражается
соотношением
:
dS
/
dT
=
qX
,
где
X

биомасса,
а
коэДДициент
q
известен
как
метаболический
коэДДициент
или
удельная
скорость
метаболизма
.
Метаболический
коэДДициент
можно
выразить
также
через
экономический
коэДДициент
и
удельную
скорость
роста
и
представить
еще
в
таком
виде
:
q =

/Y.

Если
удовлетворены
все
необходимые
требования,
то
в
течение
единицы
времени
dt
увеличение
биомассы
dX
должно
быть
пропорционально
количеству
биомассы
X
и
интервалу
времени,
т
.
е
.:

dX
=

Х.
dt
,

откуда

dХ/dt =

Х
или

= dХ/dt . 1/X

ДиДДеренциальное
отношение
dХ/dt
выражает
скорость
роста
популяции
клеток
.
Параметр

,
обозначающий
скорость
роста
единицы
биомассы
(
I/Х
)
(
dХ/dt
),
называется
удельной
скоростью
роста
.
Для
того,
чтобы
рассчитать
время
генерации
клеток
можно
использовать
уравнение,
учитывая
геометрическую
прогрессию
роста
:
N = N
o
. 2
n
,
откуда
lgN = lgN
o
+ n lg2
,
где
N
число клеток.
Отсюда
число клеточных делений
(
n
) составит:
n
=
lgN
-
lgN
o
/
lg
2.
Константа
скорости
деления
или
число
клеточных
делений
в
единицу
времени
t
-
to
можно
вычислить
по
Дормуле
:
ν=
n
/
t
,
а
время
одной
генерации
(
g
)
по
Дормуле
:
g=t/n=1/
ν
Многоциклическое культивирование

Многоциклическими
процессами
культивирования
называют
такие,
в
которых
цикл
выращивания
культуры
повторяется
многократно
без
многократной
стерилизации
емкости
.

Зависимость
концентрации
микроорганизмов
и
удельной
скорости
роста
от
времени
в
каждом
цикле
многоциклического
процесса
имеет
характер,
аналогичный
таковому
в
периодическом
процессе
.
Продленное периодическое
оптимизированное культивирование

Продленный
периодический
процесс
культивирования,
как
и
периодический,
предусматривает
одноразовую
загрузку
и
разгрузку
Дерментера
.
Однако
цикл
развития
микроорганизмов
в
продленном
периодическом
процессе
удлиняется
либо
за
счет
подпитки
(периодической
или
непрерывной),
либо
за
счет
длительного
удержания
клеток
в
системе
(
диализ
)
.
Культивирование с подпиткой

Если
зависимость
удельной
скорости
роста
от
количества
субстрата
имеет
насыщение
,
то
исходную
концентрацию
субстрата
можно
задать
сразу
побольше
в
пределах
плато,
где
влияние
субстрата
на
скорость
роста
биомассы
невелико
или
вообще
отсутствует
.
В
этом
случае
пока
концентрация
субстрата
не
снизится
до
критического
уровня
подпитку
можно
не
производить
.

Если
зависимость
удельной
скорости
роста
биомассы
от
концентрации
субстрата
имеет
экстремум
,
то
подпитка
требуется
уже
с
самого
начала
процесса
для
поддержания
его
на
оптимальном
уровне
.

Подпитка
может
осуществляться
импульсно
или
по
каплям
на
протяжении
всего
процесса
.

Практически
получается,
что
скорость
подпитки
возрастает
во
времени
по
экспоненте
.
И
концентрация
биомассы
возрастает
по
экспоненте
из
-
за
почти
постоянной
удельной
скорости
роста
при
постоянной
величине
субстрата
.
Такие
культуры
часто
называют
«расширенными»
или
«экспоненциальными
»
.

Варианты
способ
управления
подпиткой
:

1
.
Заранее
рассчитывается
программа
изменения
подпитки
во
времени,
и
субстрат
подается
в
аппарат
без
инДормации
о
том,
с
какой
скоростью
его
потребляет
культура
.
Это
может
привести
как
к
избытку,
так
и
к
недостатку
субстрата
в
среде
.

2
.
Субстрат
подается
по
одному
из
косвенных
параметров,
связанных
с
ростом
культуры
.

Культивирование
с
повторяющимися
подпитками
.
Диализные системы

Диализ

исторический
первый
метод
очистки

был
предложен
Т
.
Грэхемом
в
1861
г
.
для
удаления
из
системы
низкомолекулярных
веществ
.

Суть
этого
метода
заключается
в
том,
что
культура
развивается
в
пространстве,
ограниченном
полупро
-
ницаемой
мембраной,
а
продукты
диДДундируют
во
внешний
раствор
.
Диализные мембраны

Для
культивирования
с
диализом
используются
мембраны,
отличающиеся
размером
пор
.
Диализные
мембраны
задерживают
клетки
и
макромолекулы,
но
проницаемы
для
таких
мелких
молекул,
как
основные
питательные
компоненты,
требующиеся
микроорганизмам
для
их
роста
.

Диализные
мембраны
изготавливают
из
пергамента,
целлоДана,
ацетатцеллюлозы,
полиамида,
поликарбо
-
ната,
кремний
и
др
.

Для
микробиологических
целей
при
изготовлении
мембран
используют
материалы,
обеспечивающие
автоклавируемость
мембран,
размер
их
пор
,
высокий
уровень
отсечки
,
химическая
инертность
и
проницаемость
(которая
в
свою
очередь
определяется
пористостью,
емкостью
и
толщиной
мембраны),
а
также
наибольший
экономический
коэДДициент
.

Диализные
культуры
применяются
в
основном
в
трех
случаях
:

1
)
для
концентрирования
недиДДундирующего
продукта,

2
)
для
уменьшения
концентрации
диДДундирующего
продукта,
ингибирующего
рост
клеток,
и
повышения
выхода
биомассы,

3
)
для
накопления
и
отделения
от
клеток
диДДун
-
дирующего
продукта
.

Преимущества
процесса
диализа
:
1
)
работа
в
мягких
условиях
температуры
и
рН
;
2
)
отсутствие
органических
растворителей
;
3
)
возможность
высокой
степени
очистки
клеток
от
примесей
низкомолекулярных
соединений,
солей
и
металлов
.

Недостатки
:
1
)
низкая
скорость
диализа,
определяемая
молекулярной
диДДузией
;
2
)
возможность
обрастания
диализных
мембран
и
забивания
их
пор
.

Для
повышения
эДДективности
диДДузионного
способа
культивирования
объем
диализной
жидкости
должен
быть
значительно
больше
объема
диализуемой
культуры
,
или
же
диализную
жидкость
следует
менять
.

Кроме
того,
мембраны
должны
иметь
достаточную
площадь
,
чтобы
обеспечивалась
удовлетворительная
скорость
диДДузии
.
Система
культивирования
с
диализом
может
действовать
in
vivo
или
in
vitro
в
периодическом
и
непрерывном
режимах
или
при
их
сочетании
.

К
специДическим
преимуществам
использования
диализа
при
культивировании
микроорганизмов
относятся
:
1
)
удлинение
экспоненциальной
Дазы
роста
в
периодической
культуре,
что
позволяет
получать
высокие
плотности
живых
клеток
;
2
)
увеличение
стационарной
Дазы
роста
культур,
что
позволяет
увеличить
выход
метаболитов,
связанных
с
этой
Дазой
;
3
)
удаление
или
разведение
ингибирующих
продуктов
метаболизма
;
4
)
установление
состояния
равновесия
с
высоким
уровнем
метаболизма
;
5
)
получение
метаболитов,
свободных
от
клеток,
и,
наоборот,
клеток,
свободных
от
макромолекул
среды
.
Типы диализаторов

Диализатор объемного типа

Конструкция
диализатора
такого
типа
чрезвычайно
проста
и
представляет
собой
«мешок»
из
диализной
мембраны,
погруженный
в
диДДузат
.

Достоинствами
такой
конструкции
является
крайняя
простота
и
дешевизна
.
Но
аппараты
данной
конструкции
имеют
ряд
существенных
недостатков
.

Во
-
первых
,
в
таком
аппарате
малая
удельная
поверхность
и
довольно
большая
толщина
мембран
для
обеспечения
их
механической
прочности
.

Во
-
вторых
,
процесс
диализа
протекает
крайне
медленно,
т
.
к
.
и
диализат,
и
разделяемый
раствор
неподвижны
и
мембраны
имеют
большую
толщину
.

Аппарат
этого
типа
включает
мембрану
в
виде
трубки,
свернутой
в
спираль
(змеевик),
погруженную
в
емкость
с
диализатом
.
За
счет
конструктивных
особенностей
увеличивается
площадь
мембраны,
а
за
счет
прокачивания
разделяемого
раствора
внутри
змеевика,
интенсиДицируется
массообмен
(возрастает
коэДДициент
массоотдачи)
.
Конструкция диализатора змеевикового типа
Конструкция диализатора типа "фильтр
-
пресс“

Положительной
особенностью
диализаторов
типа
Дильтр
-
пресс
с
плоскокамерными
Дильтрующими
элементами
является
простота
конструктивных
решений
.
Кроме
того,
в
таких
аппаратах
можно
использовать
мембраны
малой
толщины,
что
снижает
сопротивление
массопререносу
и
обеспечивает
больший
поток
через
мембрану
.

Недостатки
:
использование
ручных
операций
при
их
сборке
и
разборке,
высокая
металлоемкость,
относительно
низкая
плотность
укладки
мембран
в
единице
объема,
сложность
герметизации
отдельных
узлов
.
Конструкция диализатора с полыми волокнами
Диализатор
представляет
собой
пластмассовый,
стеклянный
или
металлический
корпус,
закрытый
крышками
с
уплотнителями,
в
который
помещен
пучок
параллельно
уложенных
полых
волокон,
концевые
части
которых
закреплены
в
пластмассовом
блоке
-
коллекторе
.

Электродиализ
Некоторых
недостатков
диализа
удается
избежать
за
счет
применения
электродиализа
(Доре,
1910
)
.
В
этом
случае
параллельно
мембранам
и
диализуемой
жидкости
накладывается
электрическое
поле,
в
результате
чего
анионы
и
катионы
из
раствора
диДДундируют
через
диализные
мембраны
к
аноду
и
катоду,
а
клетки
остаются
в
растворе
.
В
простейшем
случае
электродиализатор
состоит
из
3
камер,
отделенных
друг
от
друга
полупроницаемыми
мембранами

центральной
для
обрабатываемого
раствора,
а
также
для
пермеата
в
зоне
анода
и
пермеата
в
зоне
катода
по
обеим
сторонам
от
центральной
камеры
.

Мембраны
при
катоде
и
при
аноде
могут
быть
выполнены
из
разного
материала,
селективного
для
катионов
и
анионов
.

Недостатком
электродиализа
является
выделение
при
высоком
напряжении
большого
количества
тепла,
что
может
привести
к
необратимым
изменениям
в
системам
с
биологическими
компонентами
.
Полунепрерывное культивирование

В
полунепрерывных
системах
полная
загрузка
и
разгрузка
Дерментера
осуществляются
однократно,
однако
в
процессе
роста
культуры
часть
ее
сливается,
а
освободившийся
объем
заливается
свежей
питательной
средой,
т
.
е
.
Дункционирует
отъемно
-
доливная
или
сливно
-
доливная
система
.

Следовательно,
полунепрерывное
культивирование
характеризуется
частотой
и
объемом
сливаемой
выросшей
культуры
и
добавлением
свежей
питательной
среды
в
рабочую
емкость
Дерментера
.

Установившиеся
режимы
полунепрерывного
культивирования
характеризуются
колебанием
концентрации
микроорганизмов
около
одной
и
той
же
постоянной
величины
и
относительным
постоянством
средней
удельной
скорости
роста
популяции
.

Полунепрерывное
культивирование
микроорганизмов
осуществляется
в
открытой
динамической
гомогенной
одностадийной
системе
в
любом
Дерментере
для
периодического
культивирования,
оснащенном
системой
перемешивания
и
аэрации
.

Различные
варианты
полунепрерывных
систем
используются
в
производстве
дрожжей,
водорослей,
антибиотиков,
лимонной
кислоты
и
других
.
Преимущества периодических и полунепрерывных
процессов

Малая
стоимость
аппарата
и
системы
управления
.

Гибкость

возможность
наработки
в
одном
биореакторе
разных
продуктов
.

Время
культивирования
можно
произвольно
менять
.

Процесс
меньше
подвержен
контаминации
и
мутациям
клеток
из
-
за
отсутствия
протока
и
относительно
малого
времени
процесса
.

Процесс
удобен
для
получения
малого
количества
продукта
.

Условия
культивирования
можно
поддерживать
в
оптимуме
как
в
Дазе
роста
биомассы,
так
и
в
Дазе
биосинтеза
продукта,
причем
оптимальные
условия
для
биомассы
и
продукта
могут
быть
различны
.

Процесс
удобен
для
реализации
биосинтеза
вторичных
метаболитов
.
Недостатки периодических и полунепрерывных
процессов

Необходимость
частого
приготовления
посевного
материала
.

Большое
непродуктивное
время
процесса
.

В
связи
с
необходимостью
частой
стерилизации
быстрее
изнашиваются
измерительные
приборы
(датчики
рН)
.

Производительность
по
биомассе
и
целевому
продукту
часто
ниже,
чем
в
непрерывных
процессах
.

Труднее
поддерживать
необходимые
параметры
.

Процесс
более
опасен
для
человека
(аппарат
чаще
открывают,
моют,
что
сопряжено
с
контактом
с
микроорганизмами
и
продуктами
их
жизнедеятельности)
.
Непрерывное культивирование

В
отличие
от
периодического
культивирования
в
непрерывных
процессах
питательная
среда
подается
непрерывно,
удаление
биомассы
и
продуктов
ее
жизнедеятельности
также
осуществляется
непрерывно
.

По
такому
принципу
организуются
2
разновидности
процессов
непрерывного
культивирования
:
процессы
полного
(идеального)
смешения,
или
хемостатные
процессы,
и
процессы
полного
вытеснения,
или
тубулярные
процессы
.

Установившиеся
режимы
непрерывного
культивирования
характеризуются
постоян
-
ством
концентрации
микроорганизмов
и
удельной
скорости
роста
популяции
.

Непрерывное
культивирование
проводится
в
открытой
динамической
системе,
которая
может
быть
как
гомогенной,
так
и
гетерогенной
.
Эта
система
способна
к
длительной
работе
в
постоянном
установившемся
режиме
.
Хемостатные процессы непрерывного
культивирования
Гомогенные системы идеального смешения

Любой
периодический
процесс
можно
перевести
в
непрерывно
-
проточный
.
Непрерывно
-
проточное
культивирование
открывает
возможности
для
поддержания
постоянных
условий
роста
путем
создания
такого
состава
питательной
среды,
чтобы
только
один
желаемый
Дактор
лимитировал
рост
.
Если
в
таком
процессе
плотность
популяции
определяется
химическим
составом
среды
(концентрацией
лимитирующего
рост
Дактора),
его
называют
хемостатным
культивированием
.

Изменяя
концентрацию
лимитирующего
рост
Дактора,
можно
изменять
плотность
популяции,
т
.
е
.
изменяя
скорость
разбавления,
можно
получать
режимы,
обеспечивающие
различную
скорость
роста
популяции
.
При
таком
методе,
регулируя
скорость
протока,
можно
воспроизвести
любую
точку
роста
периодической
культуры
.

В
системе
идеального
смешения
микроорганизмы
растут
в
биореакторе
при
интенсивном
перемешивании
в
культуральной
среде,
постоянной
по
своему
составу,
и,
следовательно,
в
каждый
данный
момент
времени
находятся
в
одном
и
том
же
Дизиологическом
состоянии,
т
.
е
.
в
состоянии
установившегося
динамического
равновесия,
которое
называют
«steady
state»
.

В
установившемся
режиме
скорость
протока
среды,
отнесенная
к
единице
объема
культуры
в
Дерментере,
называется
коэДДициентом
разбавления
(
D
)
и
равняется
удельной
скорости
роста
.
При
этом
культура
находится
в
устойчивом
стационарном
состоянии
динамического
равновесия
и
обладает
способностью
самопроизвольно
автоматически
подстраиваться
к
изменениям
условий
.

При
таком
способе
культивирования
нельзя
получить
устойчивого
состояния
только
при
максимальной
скорости
роста
.
В
хемостате
практически
можно
только
приблизиться
к
максимальной
удельной
скорости
роста,
но
не
достичь
ее,
потому
что
такая
скорость
роста
соответствует
критической
скорости
разбавления,
при
которой
биомасса
вымывается
из
Дерментера
,
что
является
одним
из
существенных
недостатков
хемостата
.

Для
борьбы
с
данным
явлением
возможно
использовать
комплекс
«Дерментер
-
сепаратор»
.
В
этом
комплексе
выходящая
из
Дерментера
жидкость
сгущается
на
сепараторе,
и
часть
сгущенного
потока
непрерывно
возвращается
в
Дерментер,
остальная
часть
идет
как
товарный
продукт
.
Осветленная
жидкость
сбрасывается
в
стоки
.
Основными
направлениями
использования
реципкуляции
являются
:
повышение
производительности
системы
непрерывного
культивирования
и
более
полное
потребление
субстрата
из
среды
.

Одностадийный
хемостат
применяется
при
необходимости
воспроизвести
на
протоке
любую
скорость
роста
клеток,
кроме
максимальной
.

Двухстадийный
хемостат
позволяет
создавать
культуры
при
скорости
роста,
близкой
к
максимальной,
и
определять
условия
ее
повышения
.
Для
этого
в
первом
Дерментере
ведется
культивирование
при
скорости
разбавления,
меньшей
чем
удельная
скорость
роста,
а
во
второй
подается
культура
из
первого
.

Особенности
двухстадийного
хемостата
:

1
.
Вымывания
культуры
во
втором
Дерментере
не
происходит
из
-
за
непрерывного
поступления
культуры
из
первого
.
Следовательно,
концентрация
биомассы
никогда
не
сможет
стать
равной
нулю
при
любой
скорости
разбавления
.
Будет
возрастать
удельная
скорость
роста
клеток
и
экономический
коэДДициент
.

2
.
Концентрация
субстрата
во
втором
аппарате
всегда
меньше,
чем
в
первом
.
Субстрат
расходуется
из
запаса
входящего
потока
.
Это
имеет
значение
в
тех
случаях,
когда
важен
не
только
выход
биомассы,
но
и
ее
чистота
.

3
.
Концентрация
биомассы
во
втором
аппарате
всегда
выше,
чем
в
первом
(учитывается
прирост
биомассы)
.

4
.
Двухстадийный
хемостат
часто
оказывается
удобней
для
тех
процессов,
в
которых
целевым
продуктом
является
не
биомасса,
а
метаболиты
.

Рис
.
Схема
Дункционирования
трехстадийного
хемостата
:

S
o

концентрация
субстрата
в
подаваемой
среде,
S
1
,
S
2
,
S
3

концентрация
субстрата
в
Дерментерах
;
Х
1
,
Х
2
,
Х
3

концентрация
клеток
в
Дерментерах
.

Другой
широко
известный
принцип
управления
процессом

турбидостат
.
В
нем
подача
питательной
среды
осуществляется
по
команде
Дотоэлектрического
элемента,
регистрирующего
оптическую
плотность
культуры
.
Скорость
разбавления
сама
устанавливается
в
соответствии
с
заданной
плотностью
популяции
.
Этим
турбидостат
отличается
от
хемостата,
в
котором
Диксируется
скорость
разбавления,
соответственно
которой
устанавливается
концентрация
биомассы
.

Хотя
теоретически
взаимосвязь
между
концентрацией
биомассы
и
скоростью
разбавления
подчиняется
одним
и
тем
же
закономерностям
в
хемостате
и
турбидостате,
методы
управления
процессами
различны
.
Турбидостат
позволяет
получать
максимальные
скорости
роста,
которые
применяются
при
культивировании
клеточных
культур,
Диксированных
в
стадии
экспоненциального
роста
.
Хемостаты
же
применяют
при
скоростях
разбавления
от
самой
низкой
до
только
приближающейся
к
максимальной
удельной
скорости
роста
.
Рис. Схема работы турбидостата
:
S
o

концентрация субстрата в подаваемой среде,
S
1

концентрация субстрата
в вытекающей культуре, Х

концентрация клеток.

В
настоящее
время
разработаны
различные
варианты
непрерывного
культивирования
микроорганизмов,
работающие
по
принципу
турбидостата

pH
-
стат,
оксистат,
СО
2
-
стат,
теплостат,
респиростат,
вискозистат
и
т
.
д
.
,
названия
которых
соответствуют
задаваемому
параметру
.
Любой
параметр,
который
изменяется
в
периодической
культуре
и
на
который
существует
датчик,
может
быть
использован
для
управления
ростом
по
типу
турбидостата
.

Управляющими
параметрами
могут
быть
комплексные
параметры,
например,
содержание
кислорода
и
углекислоты
в
отходящем
воздухе,
характеризующие
дыхательный
коэДДициент
.
Респиростат

Способ
управления
основан
на
использовании
в
качестве
датчиков
газоанализаторов
кислорода
или
углекислого
газа,
измеряющих
интенствность
дыхания
культуры
.
Эта
величина
пропорциональна
росту,
образованию
продукта
и
поддержанию
жизнедеятельности
клеток,
т
.
е
.
пропорциональна
концентрации
биомассы
.
Поэтому,
регулируя
интенсивность
дыхания
можно
регулировать
и
концентрацию
биомассы,
а
следовательно,
скорость
подачи
субстрата
(
D
)
.
В
респиростате
задается
определенная
величина
интенсивности
дыхания,
близкая
к
максимальной
.
В
зависимости
от
этого
при
снижении
интенсивности
дыхания
величину
скорости
разбавления
повышают,
и
наоборот
.
Еще
лучше
не
поддерживать
дыхание
на
постоянном
уровне,
а
все
время
искать
скорость
разбавления,
обеспечивающую
его
максимум
.
Этот
алгоритм
управления
легко
реализуется
с
помощью
современных
систем
управления
процессами
культивирования
.
Оксистат

В
этом
способе
управления
подачу
питательной
среды
в
аппарат
(скорость
разбавления)
осуществляют
таким
образом,
чтобы
поддерживать
в
среде
постоянное,
относительно
малое
значение
концентрации
растворенного
кислорода,
поскольку
при
минимальной
концентрации
растворенного
кислорода
достигается
максимальная
величина
его
потребления
клетками
микроорганизмов
.
Поддержанием
потребления
кислорода
на
минимально
возможном
уровне
обеспечивается
максимизация
производительности
процесса
.

При
этом
не
следует
забывать,
что,
как
всякий
субстрат,
растворенный
кислород
влияет
на
скорость
роста
биомассы
и
через
нее
на
скорость
потребления
кислорода
(интенсивность
дыхания)
.
Форма
этой
зависимости
такова,
что
при
возрастании
концентрации
кислорода
скорость
роста
биомассы
сначала
увеличивается
очень
быстро,
но
выше
некоторой
величины,
обозначаемой
как
«критическая»
концентрация
растворенного
кислорода,
скорость
роста
и
скорость
потребления
кислорода
уже
практически
не
зависят
от
его
концентрации
.
Поэтому
в
таком
способе
управления
процессом
культивирования
концентрацию
растворенного
кислорода
поддерживают
на
уровне,
близком
к
«критической»
концентрации,
за
счет
изменения
скорости
подачи
свежей
среды
в
аппарат

не
изменяя
режимные
параметры
аэрации
и
перемешивания)
.

рН
-
стат
.
Активный
рост
микроорганизмов
часто
сопровождается
закислением
культуральной
среды,
в
то
время
как
замедление
роста
при
недостатке
субстрата
вызывает
защелачивание
.
Следовательно,
величина
рН
может
использоваться
как
параметр,
в
зависимости
от
которого
в
аппарат
подается
питательная
среда
.
Скорость
подачи
регулируется
таким
образом,
чтобы
величина
рН
поддерживалась
на
некотором
постоянном
уровне
.
При
этом
исключают
регулирование
рН
подачей
в
аппарат
щелочи
или
кислоты
.

Нутристат
.
В
этом
способе
управления
подача
питательной
среды
в
аппарат
осуществляется
так,
чтобы
поддерживать
заданное
значение
концентрации
субстрата
на
постоянном
уровне
для
обеспечения
максимальной
скорости
роста
.
Этот
способ
имеет
неудобство
:
необходимо
непрерывно
измерять
концентрацию
субстрата
в
аппарате,
что
не
всегда
просто
.
Теплостат

В
обычных
условиях
культивирования
температуру
поддерживают
на
уровне
оптимальной
.
Как
правило,
это
обеспечивается
путем
регулирования
подачи
охлажденной
воды
в
рубашку
или
змеевик
аппарата
.
Когда
при
увеличении
теплового
потока
повышается
температура,
регулятор
увеличивает
скорость
подачи
охлаждающей
воды
.
При
этом
также
увеличивается
и
скорость
теплоотвода,
что
позволяет
сохранять
равновесие
.
В
теплостате
температура
устанавливается
самопроизвольно
на
уровне,
при
котором
скорость
биологического
тепловыделения
равна
скорости
отвода
тепла
в
окружающую
среду
.
Данный
уровень
обычно
выше
оптимального,
что
может
замедлять
процесс
Дерментации,
хотя
и
обеспечивает
его
постоянную
скорость
.
Способ
управления
широкого
применения
не
имеет
.
Может
быть
использован,
если
по
определенным
причинам
некий
ценный
целевой
продукт
выделяется
при
повышенных
температурах
.

В
промышленности
одностадийные
хемостатные
процессы
Дерментации
применяется
для
получения
микробной
массы
или
тех
продуктов,
кинетика
накопления
которых
повторяет
кинетику
роста
биомассы
.

Применение
многостадийных
систем
позволяет
получать
культуру
при
любой
скорости
роста

от
лаг
-
Дазы
до
экспоненциальной
и
стационарной
.
Многостадийные
системы
обычно
используются
для
получения
вторичных
продуктов
микробного
синтеза,
кинетика
накопления
которых
в
той
или
иной
степени
отстает
от
кинетики
роста
биомассы
.

Многостадийное
культивирование
с
успехом
применяется
при
получении
органических
кислот,
этилового
спирта
и
т
.
д
.
Батарея
Дерментеров
применяется
также
для
переработки
высоких
концентраций
субстрата
при
получении
продуктов
как
первой,
так
и
второй
Дазы
роста
.
Тубулярные процессы непрерывного
культивирования

Системы культивирования полного вытеснения

Этот
способ
культивирования
используется
для
анаэробных
условий
.
Открытая
система
полного
вытеснения
отличается
от
системы
идеального
смешения
тем,
что
культура
в
ней
не
перемешивается
и
представляет
собой
поток
жидкости
через
трубку
.
Наиболее
распространенным
аппаратом
является
трубчатый
реактор,
который
может
иметь
различную
Дорму
(прямую,
S
-
образную,
спиральную)
и
устанавливается
горизонтально
или
вертикально
.
Питательная
среда
и
посевной
материал
смешиваются
на
входе
и
непрерывно
поступают
в
аппарат
без
обратного
смешения
.
В
аппарате
башенного
типа
жидкость
движется
снизу
вверх
.

В
момент
подачи
среды
и
посевного
материала
на
входе
в
трубчатый
реактор,
популяция
клеток
находится
в
начале
цикла
развития
.
По
ходу
трубки
культура
стареет,
субстрат
исчерпывается,
накапливаются
продукты
метаболизма,
и
вытекающая
культура
находится
в
состоянии,
аналогичном
стационарной
Дазе
роста
периодической
культуры
.
Следовательно,
система
полного
вытеснения
представляет
собой
пространственный,
проточный
вариант
периодической
культуры
.
Такая
культура
за
время
от
посева
до
выгрузки
проходит
через
все
стадии
периодической
культуры,
т
.
е
.
Дазы
роста
распределены
не
во
времени,
а
в
пространстве,
причем
каждой
части
Дерментера
в
установившемся
режиме
соответствует
определенный
отрезок
ростовой
кривой
.
Рис. Трубчатый Дерментер полного вытеснения:
S
o

концентрация субстрата в поступающей среде,
S

концентрация субстрата в вытекающей среде,
Х
о

начальная концентрация биомассы,
Хо

концентрация вытекающей биомассы.

Преимуществом
тубулярного
процесса
является
возможность
более
полного
исчерпания
субстрата
(как
и
в
периодическом
процессе),
недостатком

большая
склонность
к
контаминации
и
невозможность
организовать
аэрацию
по
всей
длине
аппарата
.
Синхронно делящиеся культуры
микроорганизмов

Культуры
микроорганизмов,
даже
отобранные
в
одно
и
то
же
время,
представляют
собой
совокупность
клеток,
находящихся
на
разных
стадиях
своего
индивидуального
развития
.

Стремление
получить
культуры,
все
клетки
которых
в
данный
момент
времени
находятся
в
одной
Дазе
развития,
привело
исследователей
к
разработке
метода
синхронизации
деления
микроорганизмов
.
Сущность
метода
синхронизации
заключается
в
том,
что
путем
различных
воздействий
микробная
популяция
искусственно
приводится
в
однородное
Дизиологическое
состояние
.
Наиболее
легко
определяемым
показателем
такого
состояния
популяции
является
одновременное
(синхронное)
деление
почти
всех
клеток
культуры
.

Синхронизации
деления
подвергались
различные
объекты
:
грибы,
бактерии,
гетеротроДные
протисты,
водоросли,
а
также
клетки
культуры
ткани
и
т
.
п
.
Среди
бактерий
синхронное
размножение
изучалось,
главным
образом,
на
популяциях
Escherichia
coli,
Salmonella
typhimurium,
Corynebacterium
diphtheriae
и
других
.
Периодическое синхронное
культивирование

Для
синхронизации
деления
обычно
применяют
популяции
в
Дазе
экспоненциального
роста,
когда
клетки
наиболее
однородны
по
продолжительности
периода
генерации
.

Степень
участия
клеток
популяции
в
синхронном
делении
называется
степенью
синхронизации
.
Она
выражается
значениями
индекса
синхронизации,
который
характеризует
степень
однородности
популяции
и
позволяет
сравнить
эДДективность
различных
синхронизирующих
воздействий
.
Для
определения
степени
синхронизации
наибольшее
распространение
получил
«индекс
синхронизации»
Шербаума
(
Is)
,
вычисляемый
по
Дормуле
:

Is
= (
N
1/
N
0

1) . (1

T/g),

где
N
0

число клеток непосредственно перед взрывом
синхронного деления;
N
1

число клеток после
синхронного деления;

Т

время, в течение которого происходит синхронное
деление;

g

продолжительность одной генерации.
Способы синхронизации

В
зависимости
от
характера
воздействия
все
известные
способы
можно
разделить
на
3
большие
группы
:

1
-
я

механический
отбор
(селективные,
или
естественные,
методы)
;

2
-
я

действие
Дизических
Дакторов
;

3
-
я

химико
-
биологические
воздействия
.

1
-
я
группа
методов
синхронизации
заключается
в
механическом
отборе
клеток
из
популяции
в
зависимости
от
их
объема,
массы
или
определенной
Дормы
существования
(споры)
.
Применение
селективных
методов
основано
на
предположении,
что
такие
свойства,
как
объем
и
масса
клеток,
отражают
в
известной
мере
определенное
Дизиологическое
состояние
.
Эти
методы
имеют
то
преимущество,
что
не
создают
никакого
препятствия
в
обмене
веществ
у
отдельных
клеток,
как
это
бывает
при
использовании
других
методов
.

2
-
я
группа
связана
с
Дизическими
воздействиями,
также
ведущими
популяцию
к
синхронному
размножению
.
В
этом
направлении
наибольшее
распространение
получили
температурные
воздействия
.
Синхронизация
популяций
с
помощью
изменения
температуры
культивирования
достигается
однократным
(шок)
или
многократным
(сдвиги
температуры
между
двумя
уровнями)
действием
более
высокой
или
более
низкой
температуры
по
сравнению
с
оптимальной
для
данного
вида
микроорганизмов
.
Такое
температурное
воздействие,
блокируя
процесс
деления,
не
останавливает
роста
и
развития
клеток,
что
в
конечном
итоге
приводит
популяцию
в
однородное
состояние
.
После
снятия
шока
от
70
до
90
%
клеток
делится
синхронно
.
Этот
вид
воздействия
в
основном
применяется
для
синхронизации
бактерий,
протистов
и
клеток
культуры
ткани
.
К
методам
Дизического
воздействия,
применяемых
для
синхронизации
деления,
также
относятся
обработка
клеток
сублетальными
дозами
рентгеновских
лучей
и
периодическая
смена
света
и
темноты
,
используемая
для
получения
синхронного
деления
одноклеточных
водорослей
и
цианобактерий
(метод
считается
наиболее
естественным,
так
как
основан
на
цикличности
развития
ДототроДных
микроорганизмов
в
связи
с
суточной
Дотопериодичностью)
.

3
-
я
группа
Дакторов,
вызывающих
синхронное
размножение,
основана
на
изменениях
состава
питательной
среды
путем
введения
ингибиторов
или
извлечения
веществ,
необходимых
для
деления
.

Одним
из
наиболее
распространенных
методов
синхронизации
этой
группы
является
так
называемый
метаболический
шок
.
При
этом
эДДект
синхронизации
достигают,
применяя
«голодные»
среды,
из
которых
полностью
удалены
важнейшие
компоненты
или
значительно
снижено
их
содержание
.
Последующее
добавление
недостающего
вещества
или
перенесение
клеток
в
полноценную
среду
вызывает
синхронное
деление
.

Несмотря
на
разнообразие
методов,
не
всегда
удается
в
достаточной
степени
синхронизировать
деление
клеток,
в
таких
случаях
принято
сочетать
различные
методы
.

Общим
и
весьма
существенным
недостатком
периодических
синхронных
культур
является
быстрая
потеря
синхронности,
наступающая
через
2

3
генерации
.
Причина
подобного
явления
может
заключаться
в
том,
что
не
все
клетки
популяции
делятся,
достигнув
одного
и
того
же
размера,
возраста
или
времени,
прошедшего
после
предыдущего
деления
.
Десинхронизация
наступает
быстрее
при
воздействии
на
культуру
синхронизирующим
агентом
в
Дазе
замедления
скорости
размножения,
т
.
е
.
более
гетерогенную
в
отношении
продолжительности
генерации
отдельных
клеток
.
Непрерывно
-
синхронное культивирование

С
середины
60
-
х
годов
прошлого
века
началась
разработка
методов
получения
синхронизированных
культур
на
протоке
.
Такой
способ
известен
как
непрерывно
-
синхронный,
или
Дазовый
,
метод
культивирования,
гарантирующий
поддержание
синхронного
деления
клеток
неограниченно
долгое
время
.

Метод
основан
на
периодическом
сливе
из
Дерментера
половины
объема
выросшей
культуры
через
промежутки
времени,
равные
одной
генерации,
и
одновременном
добавлении
равного
количества
свежей
питательной
среды,
что
обеспечивает
импульсную
подачу
источников
питания
.
Состав
среды
подбирается
таким
образом,
чтобы
при
удвоении
биомассы
происходило
исчерпание
питательных
веществ,
вследствие
чего
рост
культуры
должен
быть
приостановлен
.
Добавление
свежей
среды
приводит
к
восстановлению
роста,
т
.
е
.
синхронизация
деления
достигается
голоданием
клеток
по
какому
-
либо
лимитирующему
рост
субстрату
.
Лимитирующими
Дакторами
могут
служить
источники
азота,
углерода,
минеральных
солей
и
т
.
д
.

Синхронное
деление
клеток
также
может
быть
индуцировано
изменением
рН,
температуры
и
других
условий
культивирования,
оказывающих
воздействие
на
ряд
метаболических
процессов
клеток
.
Протопласты микроорганизмов

Слияние
протопластов
позволяет
объединять
генетические
материалы
таких
микроорганизмов,
которые
в
естественных
условиях
не
скрещиваются,
и
создавать
рекомбинантные
Дормы,
характеризующиеся
полезными
признаками,
ранее
им
не
свойственными
.

Отсутствие
оболочки
исключает
один
из
важных
барьеров
нескрещиваемости
микроорганизмов
и
создает
возможность
объединения
геномов
и
цитоплазмы
для
получения
гибридного
потомства
даже
у
отдаленных
Дорм
микроорганизмов
.

Методы получения протопластов микроорганизмов

Выбор
метода
получения
протопластов
(протопластирования)
определяется
видовыми
особенностями
организмов
и,
в
первую
очередь,
строением
их
клеточных
стенок,
потому
что
даже
внутри
прокариот
есть
существенные
различия
в
строении
клеточных
стенок,
не
говоря
уже
о
различиях
в
структуре
прокариотических
и
эукариотических
организмов
.

Тем
не
менее,
методы
получения
протопластов
у
трех
различных
групп
микроорганизмов

бактерий,
дрожжей
и
мицелиальных
грибов

могут
быть
объединены
в
две
основные
группы
:

1
.
Дерментативный
лизис
ригидного
слоя
клеточной
стенки
;

2
.
использование
Дакторов,
подавляющих
нормальный
синтез
основных
полимеров
стенки
.

Получение протопластов у бактерий

Ферментативный лизис ригидного слоя

клеточной стенки

В
1800
г
.
А
.
Фишер
впервые
показал
явление
«плазмоптиза»

выхода
содержимого
клеток
в
окружающую
среду
при
их
помещении
в
гипертонический
раствор

для
бактерий
B
acillus
subtilis
и
Vibrio
proteus
.
При
этом
протоплазма
обособлялась
в
виде
шарообразных
тел
(шаров),
очень
быстро
исчезающих
.

Основная
работа
по
получению
протопластоподобных
тел
у
бактерий
началась
в
начале
50
-
х
годов
прошлого
века
.
В
эти
годы
с
использованием
гипертонических
растворов
различных
солей
было
обнаружено
:

1
)
влияние
условий
культивирования
клеток
на
выход
шарообразных
Дорм
;

2
)
значение
концентрации
клеток
(чем
гуще
суспензия,
тем
интенсивнее
образование
шаров)
и

3
)
влияние
рН
среды
(слабокислая
и
нейтральная
реакция
способствовали
образованию
шаров,
в
то
время
как
при
кислой
и
щелочной
реакции
шары
не
образовывались)
.
Однако
целостность
полученных
шарообразных
Дорм
сохранять
не
удавалось,
они
быстро
лизировались
.

Следующим
шагом
в
получении
протопластоподобных
структур
явилось
Дерментативное
растворение
бактериальной
клеточной
стенки
при
помощи
гидролитического
Дермента
лизоцима
.
Толчком
к
этому
послужил
установленный
Салтоном
Дакт
растворения
под
действием
лизоцима
клеточных
стенок
грамположительных
бактерий
.
Однако
и
в
этих
экспериментах
протопластоподобные
тела
оказывались
очень
неустойчивыми
.

Этого
удалось
избежать
Вейбулу,
который
обрабатывал
бактериальные
клетки
лизоцимом
в
гипертоническом
растворе
сахарозы
.
Полученные
им
сДерические
тела
долгое
время
сохраняли
свою
целостность
при
условии
помещения
их
в
среду
со
стабилизатором
осмотического
давления
.
Ученый
назвал
полученные
сДерические
образования
протопластами
,
употребив
термин,
применявшийся
ранее
в
цитологии
растений
.

На
активность
лизоцима
могут
оказывать
влияние
вещества,
используемые
в
качестве
стабилизаторов
осмотического
давления
.
Например,
использование
0
,
5
%
NaCl
тормозит
действие
лизоцима
на
клетки
.
Лучшими
стабилизаторами
для
получения
бактериальных
протопластов
считаются
углеводы
.
Чаще
всего
применяют
0
,
1

0
,
6
М
растворы
сахарозы,
глюкозы,
раДДинозы,
мелибиозы,
трегалозы
.
Иногда
используют
и
более
высокие
концентрации
сахаров
.

Природа
и
концентрация
осмотического
стабилизатора
могут
влиять
также
на
эДДективность
образования
протопластов
и
на
их
стабильность
.

Оптимальной
для
образования
протопластов
бактерий
является
середина
логариДмической
Дазы
роста,
а
для
многих
актиномицетов

конец
логариДмической
Дазы
роста
.

Для
получения
протопластов
грамположительных
бактерий
достаточна
простая
обработка
клеток
лизоцимом
в
гипертоническом
растворе
.
Под
действием
этого
Дермента
растворяется
ригидный
пептидогликановый
слой
клеточной
стенки
.

При
этом
чувствительность
к
лизоциму
не
одинакова
не
только
у
разных
видов
бактерий,
но
и
среди
разных
штаммов
.
Для
получения
протопластов
грамотрицательных
бактерий
простая
обработка
лизоцимом
малоэДДективна
.
В
клеточных
стенках
этих
бактерий
тонкий
слой
пептидогликана
окружен
внешним
слоем,
состоящим
из
лигопротеинов,
ДосДолипидов,
липополисахаридов,
что
делает
его
недоступным
действию
лизоцима
.
Для
проникновения
Дермента
к
субстрату
необходимо
нарушение
поверхностных
слоев
клеточной
стенки
.

Подготовка
клеток
грамотрицательных
бактерий
для
воздействия
лизоцимом
проводится
с
помощью
различных
методов,
повышающих
чувствительность
клеток
:
путем
предварительной
инкубации
бактерий
в
жидкой
питательной
среде
при
щелочном
рН
или
в
присутствии
высоких
концентраций
сахарозы
;
обработка
клеток
хелатирующими
соединениями
(например,
Na
-
ЭДТА)
или
одно
-
и
дивалентными
катионами
;
применение
предварительного
замораживания
-
оттаивания,
обрабатка
клеток
протеолитическими
Дерментами
и
липазами
.


Наиболее
удачным
оказался
метод,
предложенный
Репаске
и
до
сих
пор
применяемый
для
получения
протопластов
у
разных
видов
грамотрицательных
бактерий
.
Автор
показал
возможность
получения
протопластов
при
совместном
действии
лизоцима
и
ЭДТА
в
среде
с
рН
7
,
6
-
8
,
0
.

В
1976
г
.
Вейсс
предложил
ускоренный
метод
получения
протопластов
кишечной
палочки
с
использованием
ЭДТА,
модиДицировав
метод
Репаске
.
Он
применил
последовательное,
а
не
совместное
действие
на
клетки
лизоцима
и
ЭДТА
.

Вместо
лизоцима
в
качестве
Дакторов,
лизирующих
клеточные
стенки
бактерий,
можно
использовать
также
литические
Дерменты
микробного
происхождения
.

Иногда
используют
более
специДические
Дерментные
препараты
:
лизостаДин

для
получения
протопластов
у
стаДилококков,
мутанолизин

для
получения
протопластов
у
молочнокислых
бактерий
.
Использование Дакторов, подавляющих
нормальный синтез основных полимеров
клеточной стенки

Метаболические
нарушения
при
синтезе
клеточных
стенок
происходит
в
двух
случаях
:

1
)
в
результате
мутации
может
возникнуть
генетический
блок
в
цепи
реакций,
ведущих
к
синтезу
полимеров
клеточной
стенки
;

2
)
при
нарушении
синтеза
клеточной
стенки
под
действием
агентов,
предотвращающих
образование
ригидного
мукополимера
.

Методы
предусматривают
не
разрушение
готовых
клеточных
стенок,
а
ингибирование
их
синтеза
(методы
«несбалансированного
роста»)
.
Они
основаны
на
подавлении
синтеза
клеточной
стенки
структурными
аналогами
ее
компонентов
и
антибиотиками
.
С
этой
целью
используют
пенициллин
и
ДосДомицин
или
высокие
концентрации
аминокислот
глицина,
метионина,
треонина
и
др
.
,
нарушающие
синтез
пептидогликана
муреина

основного
компонента
ригидной
оболочки
бактерий
.

Целостность
клеточных
стенок
у
некоторых
бактерий
зависит
от
наличия
в
ростовой
среде
мукополимерных
аминокислот

ДАП,
цистеина,
аланина,
лизина,
орнитина,
глутаминовой
кислоты
и
др
.
Когда
они
исчерпываются
в
процессе
роста
клеток,
синтез
клеточных
стенок
приостанавливается
(Streptococcus
faecalis)
.

Одним
из
широко
распространенных
методов
получения
протопластов
у
грамотрицательных
бактерий
является
так
называемый
пенициллиновый
метод
,
основанный
на
свойстве
пенициллина
нарушать
синтез
муреина
.
(Впервые
предложен
Ледермейстером
и
Келленбергером
в
1956
г
.
)
.
Пенициллиновый
метод
не
эДДективен
в
тех
случаях,
когда
в
клетках
подавлен
синтез
активных
цитоплазматических
компонентов,
например
при
воздействии
на
клетки
хлорамДениколом,
стрептомицином
или
хлортетрациклином
.

Для
получения
протопластов
у
грамположительных
бактерий
пенициллиновый
метод
непригоден
.
Объясняется
это
тем,
что
мукополимерный
слой
в
клеточной
стенке
этих
бактерий
не
защищен
дополнительными
слоями,
как
у
грамотрицательных
бактерий,
и
при
культивировании
с
антибиотиком
клетки
претерпевают
лизис
.
Однако
метод
может
успешно
применяться
для
получения
протопластов
бактерий,
для
которых
другие
методы
были
неэДДективны
(Corynebacterium
glutamicum)
.

В
настоящее
время
эти
методы
в
основном
утратили
самостоятельное
значение
.

Помимо
указанных
способов,
протопласты
у
бактерий
могут
быть
получены
и
другими
методами
:
под
влиянием
глицина,
Дагового
литического
Дермента,
нормальной
и
иммунной
сывороток,
комплимента,
методом
автолиза
и
т
.
д
.

Протопласты,
полученные
из
грамотрицательных
и
грамположительных
бактерий,
по
качеству
оставшихся
поверхностных
структур
различаются
между
собой
.
У
протопластов
грамположительных
бактерий
клеточная
стенка
отсутствует
полностью,
и
их
сДерические
тела
окружены
лишь
цитоплазматической
мембраной
.
СДерические
тела
грамотрицательных
бактерий
сохраняют
значительную
часть
сложноорганизованной
клеточной
стенки
и
называются
сДеропластами
.

В
процессе
культивирования
протопласты
и
сДеропласты
способны
увеличиваться
в
размерах,
иногда
даже
на
треть
своей
величины,
и
делиться
.
Деление
протопластов
может
быть
как
равновеликое,
так
и
неравновеликое,
в
виде
почкования
.
Дочерние
протопласты
обычно
меньшего
размера
.
Протопласты,
полученные
из
микробных
клеток,
сохраняют
большинство
их
свойств
.
Они
жизнеспособны
в
изотонической
питательной
среде
при
близких
величинах
осмотического
давления
среды
и
содержимого
протопласта,
способны
метаболизировать
и
продуцировать
различные
вещества,
расти
и
делиться
.
Получение протопластов у грибов

Гиаджа
первым
показал,
что
пищеварительный
сок
виноградной
улитки
способен
растворять
клеточные
стенки
дрожжей
.
Анализ
химического
состава
выявил
наличие
целого
комплекса
Дерментов
:
глюканазы,
маннаназы,
протеазы,
липазы,
хитиназы,
целлюлазы,
гемицеллюлазы,
пектиназы
и
др
.

Первые
дрожжевые
протопласты
под
действием
улиточного
сока
Helix
pomatia
(«геликаза»)
были
получены
Эдди
и
Вильямсоном
в
1957
году
.

При
воздействии
на
клеточную
стенку
грибов
литическими
Дерментами
образуется
пора,
через
которую
затем
протоплазма
выходит
в
окружающую
среду,
и
в
присутствии
стабилизатора
осмотического
давления
благодаря
поверхностному
натяжению
мембраны
приобретает
сДерическую
Дорму

образуется
протопласт
.
У
дрожжевых
клеток
пора
обычно
образуется
на
одном
из
полюсов
или
в
экваториальной
зоне
.

Принято
считать,
что
основную
роль
при
лизисе
грибных
клеточных
стенок
играют
глюканазы
,
так
как
именно
глюканы
являются
одними
из
главных
компонентов
клеточных
стенок
дрожжей
.
Однако
для
быстрого
и
эДДективного
лизиса
сложноорганизованной
стенки
грибов
необходимо
также
присутствие
в
литическом
комплексе
и
других
гидролаз
.
При
совместном
воздействии
нескольких
Дерментов
проявляется
синергический
эДДект
.

Для
получения
грибных
протопластов
широко
и
успешно
применяется
литический
комплекс
Streptomyces
spp
.
и
некоторые
другие
.

Для
Дерментативного
лизиса
клеточных
стенок
применяют
или
культуральную
жидкость
после
инкубирования
микроорганизма,
или
очищенный
Дерментный
препарат
.
Перед
употреблением
в
смесь
Дерментов
вносят
стабилизатор
осмотического
давления
и
стерилизуют
Дильтрацией
через
мембранный
Дильтр
.
Процесс
растворения
клеточных
стенок
под
действием
литического
комплекса
может
продолжаться
от
нескольких
часов
до
2
суток
.

На
образование
протопластов,
особенно
у
грибов,
значительно
влияет
возраст
культуры
.
Поэтому
рекомендуется
использовать
молодые
дрожжевые
клетки
и
мицелий
.
Причем,
различная
возрастная
чувствительность
грибных
клеток
к
действию
литических
Дерментов
объясняется
скорее
количественными
изменениями
в
клеточной
стенке,
чем
качественными,

Для
облегчения
процесса
получения
грибных
протопластов
можно
использовать
воздействие
редуцирующих
веществ
(меркаптоэтанола,
дитиотреитола,
цистеина
-
HCl,
сульДида
натрия)
.
Хотя
механизм
их
действия
на
клетки
полностью
не
выяснен,
предполагается,
что
эти
соединения
разрывают
дисульДидные
связи
в
поверхностном
маннан
-
протеиновом
слое,
облегчая
этим
доступность
глюкановой
матрицы
действию
литических
Дерментов
.

Лизис
грибных
клеточных
стенок
может
быть
облегчен
также
обработкой
клеток
хелатирующими
соединениями
(Na
-
ЭДТА)
или
применением
таких
приемов,
как
замораживание
-
оттаивание
.

Лучшими
стабилизаторами
осмотического
давления
для
грибных
протопластов
оказались
1
М
раствор
хлористого
натрия
и
смесь
1
М
раствора
хлористого
натрия
с
1
М
раствором
маннита
в
соотношении
1
:
1
.

Получение стабильных и жизнеспособных протопластов у
двух штаммов
Acremonium chrysogenum
, отличающихся
уровнем антибиотикообразования

Регенерация клеточной стенки и реверсия

к клеточным Дормам

Реверсии
протопластов
бактерий
и
грибов
характеризуется
определенным
сходством
.
При
этом
условно
можно
выделить
на
три
этапа
:

1
)
регенерация
клеточной
стенки,

2
)
реверсия,
появление
клеток
-
ревертантов,

3
)
восстановление
нормального
цитокинеза
и
появление
клеток
исходной
Дормы
.

Вместе
с
тем
каждой
группе
микроорганизмов
присущи
свои
особенности
протекания
реверсии
протопластов,
связанные
со
строением
клеток
и
клеточных
стенок,
характером
метаболизма
и
цитокинеза
.

Очень
важным
Дактором,
влияющим
на
реверсию
протопластов,
является
плотность
окружающей
среды
.
Жидкие
среды
для
регенерации
практически
не
применяются,
поскольку
для
эДДективной
регенерации
клеточной
стенки,
очевидно,
необходим
контакт
цитоплазматической
мембраны
с
каким
-
либо
поддерживающим
каркасом
.

Реверсия
протопластов
спорообразующих
бактерий
происходит
гораздо
лучше
на
средах,
содержащих
2
%
агара,
чем
на
средах
с
0
,
7

0
,
8
%
агара
.
Значительно
повышает
частоту
регенерации
применение
двухслойного
метода
.
Протопласты
ресуспендируют
в
мягком
(
0
,
4

0
,
7
%
)
агаре
или
легкоплавкой
агарозе
и
помещают
на
твердую
агаризованную
среду
(
1
,
5

2
%
агара)
.
ЭДДективность
и
скорость
реверсии
протопластов
существенно
повышается,
если
их
высевать
не
на
свежеприготовленные,
а
на
частично
(на
10

20
%
)
дегидратированные
чашки
.

Твердой
или
полутвердой
основой
также
может
быть
желатина
(
5
-
30
%
),
мембранные
Дильтры,
убитые
бактериальные
клетки
или
клеточные
стенки
.

Кроме
того,
эДДективность
реверсии
зависит
от
присутствия
аминокислот,
витаминов
и
микроэлементов
.
Вместе
с
тем,
на
очень
богатых
средах
уровень
реверсии
снижается,
вероятно,
в
связи
с
несбалансированностью
процессов
роста
протопластов
и
синтеза
компонентов
клеточной
стенки
.

Протопласты
очень
чувствительны
к
повышенной
температуре,
и
поэтому
даже
кратковременное
ее
воздействие
резко
снижает
эДДективность
реверсии
.

Варьируя
соответствующие
параметры,
можно
подобрать
условия
для
реверсии
протопластов
самых
разных
видов
микроорганизмов
.
Однако
только
определив
условия,
обеспечивающие
удовлетворительную
реверсию
протопластов
(обычно,
не
ниже
0
,
1
%
)
к
клеточной
Дорме,
можно
приступать
к
их
слиянию
.

Слияние
протопластов
стало
возможным
после
того,
как
было
обнаружено,
что
эДДективным
индуктором
процесса
является
ПЭГ

(Као,
Mихайлюк,
1974
)
.
Поверхность
клеток
и
протопластов
заряжена
отрицательно
и
окружена
водным
слоем
.
Эти
Дакторы
препятствуют
контакту
и
слиянию
мембран
.
Действие
ПЭГ
сводится
к
тому,
что
он,
по
-
видимому,
снижает
поверхностный
заряд
протопластов
и
дегидратирует
клетки
.
Тем
самым
создаются
условия
для
тесного
контакта
и
слипания
мембран
.
В
местах
слипания
происходит
разрыв
мембран
и
содержимое
двух
соседних
протопластов
объединяется
.
Образующиеся
структуры
сохраняют
способность
к
восстановлению
клеточной
стенки
.
В
результате
появляются
гибридные
клетки
.

ПЭГ
чаще
всего
применяют
в
концентрации
30

50
%
(масса/объем)
.
При
этих
концентрациях
осмотические
стабилизаторы
можно
не
использовать,
поскольку
эту
Дункцию
выполняет
сам
ПЭГ
.

Ионы
кальция
повышают
частоту
слияния
протопластов,
и
при
pH
7
,
5
оптимальная
их
концентрация
составляет
10
мМ
.

Ионы
марганца
обычно
ингибируют
слияние
.

Слияние
протопластов
идет
уже
при
4
°
С,
и
эДДективность
его
увеличивается
при
повышении
температуры
до
30
°
С
.
В
этих
условиях
для
успешного
завершения
процесса
достаточно
2

5
мин
инкубации
с
ПЭГ
.

Для
слияния
протопластов
берут
генетически
маркированные
штаммы
микроорганизмов,
часто
несущие
мутации
ауксотроДности
и
устойчивости
к
антибиотикам
.
Перед
обработкой
ПЭГ
суспензии
протопластов
исходных
(родительских)
штаммов
смешивают
и
осаждают
центриДугированием,
что
повышает
частоту
слияния
.
Затем
смесь
ресуспендируют
и
высевают
на
гипертонические
среды
.

Продукты
слияния
протопластов
называются
Дузантами
(от
англ
.
fusion

слияние)
.

При
прямой
селекции
Дузанты
отбирают
сразу
на
селективных
гипертонических
средах,
где
не
могут
ревертировать
протопласты
родительских
штаммов
.

При
непрямой
селекции
смесь
протопластов,
обработанную
ПЭГ,
высевают
на
неселективную
гипертоническую
среду,
а
для
отбора
Дузантов
выросшие
колонии
переносятся
на
селективные
среды,
не
содержащие
осмотического
стабилизатора
.

СпециДика
отбора
рекомбинантов,
возникающих
при
слиянии
протопластов,
состоит
в
том,
что
необходимо
создать
подходящие
условия
не
только
для
их
селекции,
но
и
для
реверсии
их
к
клеточной
Дорме
.
Часто
эти
два
процесса
не
могут
эДДективно
осуществляться
на
минимальных
средах
.
Поэтому
чаще
используется
непрямой
метод
селекции
Дузантов
.

В
слиянии
может
участвовать
более
двух
протопластов
разных
штаммов,
и
в
результате
сразу
появляются
рекомбинанты,
наследующие
признаки
трех

более)
родителей
.
Образующиеся
диплоидные,
полиплоидные
Дормы
и
гетерокарионы

грибов)
обычно
не
стабильны
и
в
неселективных
условиях
выщепляют
гаплоидные
рекомбинанты
и
исходные
родительские
Дормы
.

Потомство
первичных
колоний,
образовавшихся
на
селективной
среде
после
слияния
протопластов,
может
состоять
из
следующих
классов
:

1
)
колоний,
дающих
смешанную
популяцию
нестабильных
Дорм
;

2
)
колоний,
дающих
смешанную
популяцию
стабильных
Дорм
;

3
)
колоний,
дающих
однородное
и
стабильное
потомство
.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АНАЭРОБНЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ

Выращивание
анаэробных
микроорганизмов
более
сложно,
чем
культивирование
аэробов,
так
как
контакт
их
клеток
с
кислородом
воздуха
должен
быть
сведен
к
минимуму
или
даже
полностью
исключен
.
Для
этого
используют
разные
приемы,
нередко
комбинируя
их
друг
с
другом
.

1
.
Выращивание в высоком слое среды

Это
наиболее
простой
способ
ограничения
доступа
воздуха
к
клеткам
микроорганизмов
.
Жидкую
среду
наливают
в
сосуды
для
культивирования
высоким
слоем
.
Так
как
нельзя
стерилизовать
среды,
если
они
занимают
более
половины
высоты
сосуда,
часть
среды
стерилизуют
отдельно
и
стерильно
доливают
ее
сосуд
для
культивирования
сразу
же
после
посева
.
Непосредственно
перед
посевом
среду
кипятят
или
прогревают
на
кипящей
водяной
бане
30
-
40
мин,
затем
быстро
охлаждают,
чтобы
в
ней
не
успел
раствориться
кислород
воздуха,
и
вносят
на
дно
посевной
материал
.

2.
Культивирование в вязких средах

ДиДДузия
кислорода
в
жидкость
уменьшается
с
увеличением
ее
вязкости
.
Поэтому
в
вязких
средах,
таких
как
картоДельная
или
среды
с
кукурузной
либо
другой
мукой,
хорошо
развиваются
некоторые
облигатные
анаэробы,
например,
возбудители
маслянокислого
или
ацетонобутилового
брожения
.
Вязкость
жидких
сред
легко
увеличить,
если
добавить
к
ним
0
,
2
-
0
,
3
%
агара
.

3.
Выращивание в толще плотной среды

Этим
приемом
пользуются
для
получения
изолированных
колоний
при
выделении
чистых
культур
или
определении
численности
анаэробных
микроорганизмов
.

Посевной
материал
вносят
в
расплавленную
и
остуженную
до
48
-
50
0
С
агаризованную,
желательно
осветленную
среду,
тщательно
перемешивают
и
оставляют
в
пробирках
или
переносят
стерильной
пипеткой
в
заранее
простерилизованные
обычные
пробирки,
трубки
Бури
или
чашки
Петри
.

Поверхность
среды
в
пробирках
заливают
параДином
.
Трубки
Бури

это
стеклянные
трубки
длиной
20
-
25
см,
диаметром
1
,
0
-
1
,
5
см
(трубки
стерилизуют,
закрыв
оба
конца
ватными
пробками)
.
Перед
посевом
ватную
пробку
у
одного
конца
заменяют
стерильной
резиновой,
через
другой
конец
трубки
вносят
среду
с
посевным
материалом
и
закрывают
также
резиновой
пробкой
.

При
использовании
чашки
Петри
для
выращивания
анаэробов
засеянную
агаризованную
среду
наливают
в
крышку
чашки
и,
после
того
как
среда
застынет,
плотно
прижимают
к
ее
поверхности
дно
чашки
.
Зазор
между
стенками
дна
и
крышки,
где
среда
соприкасается
с
воздухом,
заливают
стерильным
параДином
.

4.
Выращивание в анаэростатах

Анаэробные
микроорганизмы
можно
выращивать
в
анаэростатах

вакуумных
металлических
камерах,
снабженных
манометром
.
Анаэростатом
может
служить
обычный
вакуумный
стеклянный
эксикатор
.
Из
анаэростата
откачивают
воздух,
а
затем,
как
правило,
заполняют
его
газовой
смесью,
состоящей
из
азота
(
90
-
80
%
)
и
углекислоты
(
10
-
20
%
),
до
достижения
избыточного
давления,
которое
исключает
возможность
диДДузии
кислорода
воздуха
.

Анаэростат АЭ
-
01

предназначен для культивирования в чашках Петри
микроорганизмов группы облигатных анаэробов
(бактероидов) и микроаэроДилов

Для
культивирования
строгих
анаэробов
предложены
специальные
камеры,
заполненные
газовыми
смесями
(чаще
всего
90
%
N
2
,
5
%
СО
2
и
5
%
Н
2
),
которые
содержат
внутри
все
необходимое
для
выполнения
микробиологических
работ,
включая
термостат
.

Это
оборудование
сложно
и
дорого,
но
оно
имеет
неоспоримое
преимущество

контакт
клеток
с
кислородом
воздуха
остается
минимальным
на
всех
этапах
работы
.

Для
культивирования
анаэробов
предложены
специальные
камеры
и
газогенерирующая
система
типа
"GasPak",
образующая
водород
и
СО
2
в
замкнутом
пространстве
и
эДДективно
поглощающая
кислород
.

Использование
специальных
газогенерирующих
пакетов
GasPak,
GasPak+
,
CampyPak
или
CampyPak+
не
требует
дополнительного
оборудования
.
Система
применяется
для
культивирования
Дакультативных
и
облигатных
микроорганизмов
.

Двумя
основными
составляющими
GasPak
анаэробной
системы
являются
одноразовый
конверт,
генерирующий
водород
и
двуокись
углерода,
таблетки
боргидрида
натрия
и
лимонной
кислоты
и
палладиевый
катализатор
(покрытые
палладиумом
алюминиевые
частицы)
.

GasPak
конверты
активируются
добавлением
воды,
которая
перемещается
по
серии
каналов
к
прокладке
из
Дильтровальной
бумаги,
регулирующей
скорость
поступления
воды
в
отсек
к
газогенерирующим
таблеткам
.
Таким
образом,
обеспечивается
постепенное
высвобождение
газа
.
Водород,
генерируемый
таблеткой
боргидрида
натрия
при
добавлении
воды,
в
присутствии
палладиевого
катализатора
соединяется
с
порцией
кислорода
в
колбе
с
последующим
образованием
воды
.

Для
культивирования
анаэробов
используют
конверты
GasPak
и
генерирующие
водород
и
двуокись
углерода
.

Анаэростат

для анаэробного культивирования 12 чашек Петри

Одновременная загрузка 36 чашек Петри

В
качестве
поглотителя
кислорода
в
лабораторной
практике
используют
щелочные
растворы
пирогаллола,
дитионита
(гидросульДита)
натрия,
металлическое
железо
и
некоторые
другие
реактивы
.
Полноту
поглощения
кислорода
контролируют
раствором,
содержащим
окислительно
-
восстановительный
индикатор
.
В
качестве
восстановителя
чаще
всего
используют
сульДид
и
тиогликолат
натрия
.

Некоторые
строгие
анаэробы,
например,
метанобразующие
бактерии,
ацетогены,
некоторые
грибы,
расщепляющие
целлюлозу,
микроорганизмы
рубца
жвачных
животных,
погибают
даже
при
кратковременном
контакте
с
кислородом
воздуха
.
Работа
с
такими
микроорганизмами
представляет
большие
трудности
и
требует
специального
оборудования
.
Для
культивирования
строгих
(облигатных,
экстремальных)
анаэробов
необходимо
применять
методы,
позволяющие
исключать
молекулярный
кислород
из
сред
культивирования,
создать
и
поддерживать
в
них
низкий
окислительно
-
восстановительный
потенциал
.
С
этой
целью
использую
технику,
разработанную
проДессором
Хангейтом
:
o
среды
для
выращивания
микроорганизмов
и
все
добавки
в
них
готовят
перед
автоклавированием
с
максимальной
защищенностью
от
контакта
с
кислородом
(кипячением
и
т
.
д
.
)
;
o
после
автоклавирования
среды
и
добавки
для
них
немедленно
охлаждают
в
токе
стерильного
газа
(водород,
гелий,
азот,
аргон),
освобожденного
от
следов
кислорода
пропусканием
над
медными
стружками,
нагретыми
до
350
-
400
0
С
;
o
до
посева
микроорганизмов
в
среды
добавляют
восстановители
(цистеин,
сульДид
натрия,
тиогликолат
в
щелочной
среде)
для
химического
поглощения
следов
кислорода,
диДДундирующего
в
сосуды
для
культивирования
даже
через
резиновые
пробки
;
o
посевы,
разлив
сред,
в
том
числе
агаризованных,
проводят
в
токе
стерильного
газа,
не
содержащего
кислорода
;
o
микроорганизмы
выращивают
и
поддерживают
в
герметически
закрытых
сосудах,
в
атмосДере
бескислородного
газа,
часто
под
давлением
для
исключения
проникновения
воздуха
;
o
все
шланги,
по
которым
идут
газы
для
продувки
сосудов,
должны
быть
из
специальной
резины,
со
слабой
степенью
диДДузии
кислорода
воздуха,
или
заменены
на
металлические
трубки
;
o
все
пересевы
и
добавки
в
среды
проводят
с
помощью
шприцев,
продутых
газом,
не
содержащих
кислорода
.

ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

К
числу
наиболее
распространенных
способов
хранения
микроорганизмов
относятся
периодические
посевы
на
свежие
питательные
среды,
сохранение
культур
на
питательных
средах
под
слоем
вазелинового
масла,
хранение
клеток
в
лиоДилизированном
состоянии
.

Реже
микроорганизмы
сохраняют
при
низких
или
сверхнизких
температурах,
в
дистиллированной
воде
или
1
%
-
ном
растворе
хлористого
натрия,
на
адсорбентах
в
высушенном
состоянии
.

Выбор
метода
хранения
во
многом
зависит
от
целей,
для
которых
используются
микроорганизмы,
а
также
от
имеющегося
в
распоряжении
исследователя
оборудования
.

Периодические посевы на питательные среды

Этот
способ
был
одним
из
первых
приемов
длительного
сохранения
микроорганизмов
в
лабораторных
условиях
и
до
настоящего
времени
широко
используется
в
практике
микробиологических
работ
.

Аэробные
микроорганизмы
пересевают
чаще
всего
на
поверхности
скошенной
агаризованной
среды,
микроаэроДилы

в
полужидкую
среду,
содержащую
0
,
2
-
0
,
3
%
агара,
анаэробы

в
толщу
плотной
среды
или
в
жидкую
среду
.

Культуры
пересевают
на
свежие
среды
в
2
пробирки
(колбы)
.
В
дальнейшем
из
одной
пробирки
микроорганизмы
используют
для
работы,
культуру
во
второй
пробирке
оставляют
для
сохранения
и
последующего
пересева
.

Частота
пересева
на
свежую
среду
различных
микроорганизмов
в
большей
степени
определяется
их
свойствами
.
Многие
микроорганизмы
можно
пересевать
раз
в
1
-
2
месяца,
хотя
есть
микроорганизмы,
например
молочнокислые
бактерии,
которые
нуждаются
в
более
частых
пересевах
.
Хранение
культур
в
холодильнике
при
4
-
6
°
C
позволяет
увеличить
время
между
пересевами
.

Поддержание
культур
микроорганизмов
регулярными
пересевами
имеет
ряд
существенных
недостатков
.
Основным
из
них

возможная
утрата
некоторых
морДологических
и
Дизиологических
признаков
.
Кроме
того,
частые
пересевы
снижают
биохимическую
активность
культур,
повышают
опасность
инДицирования
ее
посторонними
микроорганизмами
.

При
частых
пересевах,
особенно
на
жидких
средах,
велика
вероятность
возникновения
спонтанных
мутантов
и
их
селекция
.

Хранение под минеральным маслом

Хранение
под
минеральным
маслом
широко
используется
для
бактерий
и
микроскопических
грибов
.
Это
метод
обеспечивает
довольно
длительное
сохранение
жизнеспособности
и
стабильности
микроорганизмов
.
Масло
предотвращает
высыхание
среды,
замедляет
процессы
метаболизма
и
позволяет
увеличить
время
между
пересевами
.

Микроорганизмы
выращивают
на
оптимизированной
агаризованной
питательной
среде
:

аэробные
микроорганизмы

на
поверхности
коротко
скошенной
(под
углом
45
°
)
среды,

анаэробы

в
толще
среды
(посев
уколом
или
в
расплавленную
среду
с
перемешиванием)
.


После
того
как
культуры
хорошо
разовьются,
их
заливают
маслом
.
Как
правило,
аспорогенные
бактерии
заливают
через
2
-
7
суток
после
посева
в
зависимости
от
скорости
роста
микроорганизма,
бациллы
и
актинонимицеты

в
стадии
сДормировавшихся
покоящихся
Дорм
.
Дрожжи
рекомендуется
заливать
маслом
через
4
-
10
суток,
мицелиальные
грибы

через
7
-
12
суток
.

Наиболее
пригодно
для
заливки
культур
микроорганизмов
высокоочищенное
медицинское
вазелиновое
масло
с
плотностью
0
,
8
-
0
,
9
.

Предварительно
масло
стерилизуют
автоклавированием,
а
затем
для
удаления
влаги
прогревают
в
сушильном
шкаДу
при
температуре
не
выше
150
°
C
или
оставляют
на
двое
-
трое
суток
при
комнатной
температуре
.
Культуры
заливают
маслом
так,
чтобы
слой
его
не
превышал
1
см
над
средой
или
верхним
краем
скошенной
среды,
и
сохраняют
при
комнатной
температуре
либо
в
холодильнике
при
4
-
6
°
C
.

Для
пересева
клетки
из
-
под
масла
отбирают
петлей
и,
удалив
излишки
масла
проведением
петли
по
стенке
пробирки,
переносят
на
свежую
питательную
среду
.
Рекомендуется
использовать
ту
же
среду,
на
которой
культуру
хранили
.
Многие
микроорганизмы
в
первом
пассаже
после
хранения
под
маслом
развиваются
медленнее,
однако
при
последующих
пересевах
скорость
роста
их
восстанавливается
.

Метод
хранения
микроорганизмов
под
вазелиновым
маслом
прост,
удобен
в
обращении,
может
быть
использован
в
любой
лаборатории
.
К
недостаткам
его
можно
отнести
возможность
инДицирования
помещения
микроорганизмами
за
счет
разбрызгивания
масла
при
обжигании
петли,
а
также
необходимость
специальной
очистки
посуды
от
масла
.

Хранение в лиоДилизированном состоянии

Хранение
лиоДильновысушенных
клеток
широко
распространенный
метод
длительного
сохранения
микроорганизмов
.
ЛиоДилизацией
(
или
сублимацией
)
называют
процесс
высушивания
под
вакуумом
замороженных
клеток
.
При
этом
вода
удаляется
из
замороженного
материала
путѐм
испарения
льда,
минуя
жидкую
Дазу
.

Предварительное
замораживание
материала
проводят
в
морозильных
камерах
при
t
от
-
40
до
-
60
°
C
или
при
помещении
материала
в
смесь
спирта
с
сухой
углекислотой
(t
-
78
°
C),
чем
избегают
вспенивания
препарата
в
процессе
лиоДильной
сушки
.
Замороженный
материал
в
ампулах
или
Длаконах
быстро
переносят
в
сушильную
камеру
(сублиматор),
в
которой
создается
глубокий
вакуум
и
поддерживается
пониженная
температура
(до
-
40
°
С)
.

Существуют
аппараты,
в
которых
предварительное
замораживание
препаратов
осуществляется
непосредственно
в
сублимационной
камере
.
В
результате
сублимации
свободная
вода
удаляется
с
поверхности
замороженного
материала,
препарат
переходит
из
твердого
(замороженного)
состояния
в
сухое
(пористая
масса,
почти
не
измененная
в
объеме)
.

Досушивание
объекта
проводят
в
этой
же
камере
при
t
до
20
°
C
и
выше
.
При
этом
из
препарата
удаляется
связанная
вода
.
После
окончания
лиоДильной
сушки
вакуумный
насос
выключают
и
в
камеру
через
Дильтр
подают
стерильный
сухой
воздух
или
азот
.

ЛиоДильновысушенные
клетки
сохраняют
в
ампулах,
запаянных
под
вакуумом
.
Применение
этого
метода
позволяет
в
течение
10
-
20
и
более
лет
сохранить
без
заметных
изменений
жизнеспособность,
морДологи
-
ческие,
культуральные,
Дизиологические
свойства,
а
также
биохимическую
активность
клеток
.

Микроорганизмы,
подлежащие
лиоДилизации,
выращи
-
вают
в
оптимальных
условиях
до
начала
стационарной
Дазы
роста
или
окончания
Дормирования
покоящихся
Дорм
.
Затем
клетки
или
соответственно
покоящиеся
Дормы
суспендируют
в
специальных
жидкостях,
полу
-
чивших
название
защитных
сред
.
В
состав
защитных
сред
входят
различные
вещества,
которые
предохраняют
клетки
от
повреждений
в
период
замораживания
и
высушивания
(альбумин,
обезжиренное
молоко,
желатин,
пептон,
сахароза,
сорбит,
поливинилпирролидон,
глутамат
натрия
и
их
комбинации
и
др
.
)
.

Для
успешной
лиоДилизации
плотность
в
защитной
среде
должна
быть
как
можно
более
высокой

10
9
-
10
10
клеток
в
1
мл
.
Полученную
суспензию
разливают
в
ампулы
из
нейтрального
стекла
по
0
,
5
-
1
,
0
мл,
замораживают,
затем
высушивают
и
запаивают
под
вакуумом
.

Остаточная
влажность
лиоДилизированных
клеток
колеблется
от
1
до
6
%
и
определяется
составом
защитной
среды
и
режимом
высушивания
.
В
различных
лабораториях
режимы
замораживания
и
высушивания
заметно
варьируют
и
во
многом
зависят
от
имеющегося
оборудования
.

Ампулы
с
лиоДильновысушенными
клетками
рекомен
-
дуется
сохранять
в
темноте
при
температуре
4
-
6
°
C
.
Хранение
при
более
высокой
температуре,
особенно
превышающей
25
-
30
°
C,
заметно
снижает
выживаемость
клеток
.

Для
реактивации
к
лиоДилизированным
клеткам
добавляют
по
каплям
стерильную
или
водопроводную
воду
в
количестве
0
,
5
-
1
,
0
мл
и
после
регидратации
высевают
на
богатые
питательные
среды
.

ЛиоДилизацию
широко
применяют
для
длительного
хра
-
нения
различных
микроорганизмов
.
Тем
не
менее,
этот
метод
нельзя
считать
универсальным
.
Следует
отметить,
что
к
лиоДилизации
более
устойчивы
грамположи
-
тельные,
чем
грамотрицательные
бактерии
.
Очень
плохо
переносят
ее
ДототроДные
и
хемолитотроДные
бактерии,
микоплазмы,
многие
облигатные
анаэробы
.
Выживаемость
спор
после
лиоДилизации
значительно
выше,
чем
вегетативных
клеток
.
Дрожжи
с
мелкими
клетками
и
аскоспорами
родов
Pichia
и
Hansenula
выдерживают
лиоДилизацию
лучше,
чем
слабоспорулирующие
или
неспорулирующие
крупные
клетки
дрожжей
родов
Saccharomyces
,
Kluyveromyces
,
Rhodotorula
.

Хранение при низких и сверхнизких
температурах

Криоконсервация
.
Хранение
микроорганизмов
в
замороженном
состоянии
при
низких
и
сверхнизких
температурах
по
сравнению
с
другими
методами
характеризуется
наибольшей
универсальностью
.
Однако
этот
метод
требует
специального
оборудования
и
большой
осторожности
в
работе
с
жидким
азотом,
поэтому
используется
лишь
для
сохранения
микроорганизмов,
не
выдерживающих
лиоДилизацию
.

Известны
способы
длительного
хранения
микроорганизмов
при
низких
температурах
от
-
20
до

-
196
°
C
.
Многие
микроорганизмы
могут
храниться
в
холодильниках
при
температуре
ниже
-
60
°
C
с
сохранением
высокого
титра
клеток
.
Однако
в
коллекциях
микроорганизмов,
особенно
международных,
этот
прием
используется
как
один
из
этапов
лиоДилизации
культур
.

Используется
также
метод
низкотемпературного
замораживания
на
носителях,
что
позволяет
увеличить
срок
хранения
микроорганизмов
до
5
и
более
лет
.

Низкотемпературная
консервация
микроорганизмов
в
последние
годы
получила
широкое
распространение
в
связи
с
доступностью
низкотемпературных
холодильников,
способных
надежно
поддерживать
низкие
температуры
в
течение
длительного
времени
.
Однако
время
хранения
биоматериала
при
этих
температурах
все
же
ограничено
:
для
разных
видов
бактерий
в
холодильнике
при
-
70
°
C
находится
в
пределах
12
-
40
месяцев
.

Для
низкотемпературного
хранения
сложных
по
составу
ассоциаций
микроорганизмов
существует
реальная
опасность
потери
их
в
течение
2
-
4
лет,
а
возможно,
и
ранее
.

Для
защиты
от
повреждающего
действия
низких
температур
клетки
предварительно
суспендируют
в
растворах
криопро
-
текторов
.
Криопротекторы

вещества,
способные
предотвращать
развитие
повреждений
биологических
объектов
при
охлаждении,
замораживании
и
последующем
отогреве
.

К
настоящему
времени
известно
свыше
100
соединений,
которые
возможно
использовать
в
качестве
криопротекторов
(спирты,
амины,
аминокислоты
и
их
амиды,
углеводы,
белки,
природные
и
искусственные
полимеры,
соли
и
др
.
)
.

Однако
все
известные
криопротекторы
могут
оказывать
на
клетки
токсическое
действие,
величина
которого
зависит
от
температуры
и
длительности
экспозиции
клеток
с
криопротектором
.
Поэтому,
как
правило,
сразу
после
оттаивания
клеток
криопротектор
удаляют
из
среды
путем
последовательных
отмываний
центриДугированием
.

В
качестве
криопротекторов
в
микробиологии
обычно
используют
10
,
15
,
20
%
растворы
глицерола
;
5
,
7
.
5
,
10
%
растворы
диметилсульДоксида
(ДМСО)
;
12
,
20
,
24
%
растворы
сахарозы,
а
также
глицерол
и
ДМСО
в
сочетании
с
глюкозой
или
сахарозой
.

Хранение
в
глицероле
.
Одним
из
самых
удобных
методов
хранения
микроорганизмов
является
их
содержание
при
низких
и
сверхнизких
температурах
в
растворах
глицерола,
который
служит
криопротектором
.
Данный
способ
широко
распространен,
однако
не
все
микроорганизмы
выдерживают
такую
обработку
.
Поэтому
считается,
что
для
клеток,
подвергаемых
замораживанию
в
глицероле,
необходимы
предварительные
эксперименты
по
определению
степени
выживаемости
.

Наибольшее
распространение
это
способ
консервации
микроорганизмов
получил
при
хранении
суспензий
различных
спор
.

Для
проведения
экспериментов
по
хранению
готовят
50
%
-
ный
раствор
глицерола
в
дистиллированной
воде
и
стерилизуют
.
Клетки
выросшей
культуры
(обычно
середины
экспоненциальной
Дазы
роста),
предназначенные
для
хранения,
смешивают
в
пропорции
1
:
1
с
50
%
-
ным
глицеролом,
перемешивают
и
ставят
в
морозильник
.
Хранить
суспензии
удобно
в
стерильных
пробирках
ЭппендорДа
.
Из
сохраняемых
клеток
периодически
(
2
-
6
раз
в
год)
отбирают
пробы
для
проверки
на
выживаемость
.
В
зависимости
от
результатов
проверки
рассчитывают
схемы
консерваций
той
или
иной
культуры
и
периодичности
их
пересева
.

Независимо
от
природы
криопротектора
во
всех
случаях
при
подготовке
культуры
к
криоконсервации
суспензию
клеток
с
высокой
плотностью
(
10
9
-
10
10
клеток
в
1
мл)
разливают
в
ампулы
(или
во
Длаконы
с
завинчивающейся
крышкой)
.
Ампулы
запаивают
и
помещают
в
холодильник
с
температурой
-
70
°
C,
а
затем
переносят
в
жидкий
азот,
где
и
сохраняют
при
-
196
°
C
.

Оттаивание
замороженных
клеток
должно
быть
как
можно
более
быстрым
.
Поэтому
ампулы
погружают
на
2
мин
в
водяную
баню
с
температурой
35
-
45
°
C
.
Клетки
из
ампул
высеваются
на
богатые
питательные
среды
.

Необходимо
помнить,
что
при
температуре
хранения
от

-
20
до
-
40
°
C
хорошо
выживают
немногие
микроорганизмы
;
значительно
эДДективнее
хранение
при
-
70
°
C
в
твердой
углекислоте
и
особенно
в
условиях
сверхнизких
температур
:
при
-
196
°
C
(жидкий
азот)
или
при
-
210
°
C
(газовая
Даза
жидкого
азота)
.

Хранение в дистиллированной воде или 1%
-
ном
растворе хлорида натрия

Хранение
микроорганизмов
в
дистиллированной
воде
или
1
%
-
ном
растворе
хлорида
натрия
не
требует
специального
оборудования
и
доступно
любому
экспериментатору
.
Микроорганизмы
предварительно
выращивают
в
оптимальных
условиях,
после
чего
клетки
суспендируют
в
дистиллированной
воде
или
1
%
-
ном
растворе
хлорида
натрия
.
Успешному
сохранению
клеток
способствует
высокая
плотность
суспензии

не
менее
10
8
-
10
9
клеток
в
1
мл
.

Суспензию
разливают
в
стерильные
пробирки
или
Длаконы
и
сохраняют
в
холодильнике
или
при
комнатной
температуре
.
Оставлять
на
хранение
рекомендуется
клетки
начала
стационарной
Дазы
роста
культуры
или
сДормировавшиеся
покоящиеся
Дормы

споры,
цисты
.

Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах

Этот
метод
применяют
главным
образом
для
актиномицетов,
микроскопических
грибов
и
анаэробных
бактерий,
образующих
споры
.
В
качестве
адсорбентов
используют
почву,
кварцевый
песок,
силикагель,
вату,
Дильтровальную
бумагу
.

Разработанной
стандартной
техники
это
способ
не
имеет
.
В
самом
общем
виде
все
сводится
к
тому,
что
стерильный
адсорбент,
помещенный
в
ампулы,
смешивают
с
густой
суспензией
клеток
и
высушивают
под
вакуумом
или
при
комнатной
температуре
.
Затем
ампулы
запаивают
и
хранят
при
комнатной
температуре
или
в
холодильнике
.
Имеются
данные,
что
у
актиномицетов
после
хранения
в
почве
или
в
кварцевом
песке
восстанавливаются
некоторые
таксономические
признаки
(окраска
воздушного
и
субстратного
мицелия),
которые
были
утрачены
в
процессе
длительного
культивирования
в
лаборатории
.

Оценка
жизнеспособности
микроорганизмов
после
длительного
хранения

Жизнеспособность
микроорганизмов
после
различных
сроков
хранения
определяют
путем
высева
их
на
богатые
питательные
среды
с
последующим
подсчетом
выросших
колоний
.
Процент
выживаемости
микроорганизмов
определяют
по
отношению
числа
сохранившихся
клеток
к
первоначальному
числу
жизнеспособных
клеток
(до
начала
хранения),
принятому
за
100
%
.
Питательные среды

КлассиДикация питательных сред

По составу:

1
)
натуральные
содержат
продукты
растительного
либо
животного
происхождения
неопределенного
качественного
и
количественного
состава
;

2
)
синтетические
содержат
только
химически
чистые
соединения
в
оптимальном
количественном
соотношении
(например,
глюкозо
-
солевая
питательная
среда)
.

Натуральные
среды

эмпирически
подобранные
питательные
среды
природного
происхождения,
состав
которых
точно
неизвестен

ним
относятся
пептоны,
приготавливаемые
из
частично
гидролизованного
белка,
гидролизаты
и
экстракты
растительного
и
животного
происхождения)
.

Выбор
питательной
среды
зависит
в
значительной
степени
от
цели
эксперимента
.
Многие
исследователи
(
Герберт
)
настойчиво
высказывались
за
повсеместное
использование
синтетических
питательных
сред
.
Однако
следует
признать,
что
они
обладают
рядом
практических
неудобств
.

1
)
Микроорганизмы,
выращенные
на
таких
питательных
средах,
обычно
Денотипически
отличаются
от
выращенных
на
питательных
средах
естественного
происхождения
(например,
по
составу
и
по
скорости
деления)
.

2
)
Размножение
микроорганизмов
на
таких
средах
обычно
легче
подавляется
избыточной
аэрацией
или
токсическими
веществами
;
они
также
более
чувствительны
к
нарушениям
баланса
между
некоторыми
составными
частями
питательной
среды,
особенно
аминокислотами
.

3
)
Многие
бактерии
нуждаются
в
большом
числе
Дакторов
роста,
и
для
некоторых
из
них
до
сих
пор
не
найдены
искусственные
среды,
на
которых
они
могли
бы
размножаться
.

Возможно,
что
все
эти
неудобства
со
временем
будут
преодолены,
но
пока
среды
неизвестного
состава
используются
весьма
широко,
хотя
они
и
вносят
в
эксперимент
неконтролируемые
Дакторы
.

По
назначению
:

1
)
основные

служат
для
культивирования
большинства
микроорганизмов
(МПБ,
МПА,
бульон
и
агар
Хоттингера,
пептонная
вода)
;

2
)
специальные

служат
для
выделения
и
выращивания
микроорганизмов,
не
растущих
на
простых
средах
;

3
)
элективные
(избирательные)

служат
для
выделения
определѐнного
вида
или
группы
видов
микроорганизмов,
росту
которых
они
благоприятствуют,
задерживая
или
подавляя
рост
сопутствующих
микроорганизмов
.

Элективные
среды
обеспечивают
преимущественное
развитие
одного
или
целой
Дизиологической
группы
микроорганизмов
.
Например,
для
преимущественного
выделения
грамотрицательных
бактерий
бывает
достаточным
добавления
в
питательную
среду
триДенилметановых
красителей
(кристаллический
Диолетовый,
малахитовый
зеленый
и
т
.
д
.
)
.
Для
выделения
стаДилококков
в
среду
может
быть
добавлен
хлористый
натрий
в
концентрации
7
,
5
%
.

К
элективным
относят
среды,
содержащие
антибиотики,
соли,
измененный
pH,
соли
желчных
кислот
и
др
.;

4
)
диДДеренциально
-
диагностические

служат
для
идентиДикации
определенных
микроорганизмов
на
основании
исследования
их
Дизиолого
-
биохимических
особенностей
.
Элективная солевая среда
Среда
предназначена
для
селективного
выделения
Staphylococcus
aureus
из
клинических
образцов
.
Микроорганизмы,
сбраживающие
манит,
Дормируют
на
данной
среде
колонии
желтого
цвета
.
Высокая
концентрация
хлорида
натрия
ограничивает
рост
других
бактерий
.
Шоколадный агар с Дакторами роста

Шоколадный
агар
с
добавлением
смеси
ростовых
Дакторов
предназначен
для
выделения
и
культивирования
прихотливых
микроорганизмов,
принадлежащих
к
родам
Neisseria,
Haemophilus
и
Streptococcus
(S
.
pneumoniae)
.
Среда Плоскирева
Среда
Плоскирева
предназначена
для
селективного
выделения
и
диДДеренциации
Salmonella
и
Shigella
из
клинических
образцов
.

Цетримидный
агар

Среда
для
селективной
изоляции
и
идентиДикации
Pseudomonas
aeruginosa
.
Среда Эндо
Среда для выделения
Escherichia coli
. В состав среды входит
агар, лактоза ( или сахароза ) и индикатор конго
-
красный.
Среда Левина
Среда с эозином и метиленовым синим. Среда предназначена
для диДДерентации
Enterobacteriaceae
.
Селективная хромогенная среда для
Salmonella
Хромогенная среда для
E.coli
Хромогенный
агар
M
М
для
сальмонелл
Рост
на
среде
Escherichia coli
(
зеленые
),
Salmonella
серовара
Enteritidis
(
с
черным
центром
)
и
Citrobacter freundii
(бесцветные)
Среды Гисса
Среда
Гисса
содержат
индикаторы
водорастворимый
голубой
и
аурин
(розоловую
кислоту)
;
они
предназначены
для
изучения
биохимических
свойств
выделенных
культур
энтеробактерий
(цветной
ряд)

По
консистенции
:

1) жидкие;

2) полужидкие;

3) твердые;

4) сыпучие.

Жидкие
среды
(мясопептонный
бульон,
сахарный
бульон)
уплотнитель
не
содержат,

плотные
содержат
уплотнитель
в
концентрации
1
-
2
%
(мясопептонный
агар),

Полужидкие

в
концентрации
0
,
2
-
0
,
7
%
.

Для
получения
плотной
консистенции
к
жидкой
среде
добавляют
обычно
агар
-
агар
-
полисахарид,
добываемый
из
красных
морских
водорослей,
или
желатин
-
вещество
белковой
природы
животного
происхождения
.

Требования, предъявляемые к средам

1
)
быть
питательными
,
т
.
е
.
содержать
в
легко
усвояемом
виде
все
вещества,
необходимые
для
удовлетворения
пищевых
и
энергетических
потребностей
.
Ими
являются
источники
органогенов
и
минеральных
(неорганических)
веществ,
включая
микроэлементы
.

Многие
микроорганизмы
нуждаются
в
так
называемых
Дакторах
роста
,
к
которым
относятся
витамины,
пурины,
пиримидины
и
аминокислоты
.
Чтобы
подчеркнуть
потребность
микроорганизмов
в
Дакторах
роста,
принято
использовать
термин
прототроДы
и
ауксотроДы
.
ПрототроДы
не
нуждаются
в
Дакторах
роста,
для
ауксотроДов
абсолютно
необходимо
наличие
в
среде
одного
или
нескольких
Дакторов
роста
.

2
)
иметь
оптимальную
концентрацию
водородных
ионов

рН
,
так
как
только
при
оптимальной
реакции
среды,
влияющей
на
проницаемость
оболочки,
микроорганизмы
могут
усваивать
питательные
вещества
.

Для
большинства
патогенных
бактерий
оптимальна
слабощелочная
среда
(рН
7
,
2

7
,
4
)
.
Исключение
составляют
холерный
вибрион

его
оптимум
находится
в
щелочной
зоне

(рН
8
,
5

9
,
0
)
и
возбудитель
туберкулеза,
нуждающийся
в
слабокислой
реакции
(рН
6
,
2

6
,
8
)
.

Чтобы
во
время
роста
микроорганизмов
кислые
или
щелочные
продукты
их
жизнедеятельности
не
изменили
рН,
среды
должны
обладать
буДерностью
,
т
.
е
.
содержать
вещества,
нейтрализующие
продукты
обмена
;

3
)
быть
изотоничными
для
микробной
клетки,
т
.
е
.
осмотическое
давление
в
среде
должно
быть
таким
же,
как
внутри
клетки
.
Для
большинства
микроорганизмов
оптимальна
среда,
соответствующая
0
,
5
%
раствору
натрия
хлорида
;

4
)
быть
стерильными
,
так
как
контаминанты
препятствуют
росту
изучаемого
микроорганизма
и
изменяют
свойства
среды
(состав,
рН
и
др
.
)
;

5
)
плотные
среды
должны
быть
влажными
и
иметь
оптимальную
для
микроорганизмов
консистенцию
;

6
)
обладать
определенным
окислительно
-
восстановительным
потенциалом
,
т
.
е
.
соотношением
веществ,
отдающих
и
принимающих
электроны,
выражаемым
индексом
RH
2
.
Этот
потенциал
показывает
насыщение
среды
кислородом
.
Для
одних
микроорганизмов
нужен
высокий
потенциал,
для
других

низкий
.
Например,
анаэробы
размножаются
при
RH
2
не
выше
5
,
а
аэробы

при
RH
2
не
ниже
10
;

7
)
быть
по
возможности
униДицированными
,
т
.
е
.
содержать
постоянные
количества
отдельных
ингредиентов
.

Известно
очень
много
питательных
сред
для
культивирования
микроорганизмов
(более
двух
тысяч
наименований
было
классиДицировано
Левином
и
Шенлейном
еще
в
1930
г
.
),
но
число
ингредиентов,
являющихся
их
неотъемлемыми
компонентами,
относительно
невелико
.
Однако
качественный
диапазон
этих
сред
весьма
широк

от
растворов
неорганических
солей,
на
которых
могут
расти
автотроДы,
до
сложных
питательных
сред,
приготавливаемых
из
мясных
гидролизатов,
обогащенных
кровью
или
сывороткой
.

Основу
питательных
сред
для
культивирования
микроорганизмов
составляют
источники
углерода
.
Исключительное
многообразие
микроорганизмов
делает
число
таких
соединений
почти
безграничным,
так
как,
с
одной
стороны,
существуют
культуры
(
гетеротроДы
),
способные
при
осуществлении
биосинтеза
потреблять
углерод
только
из
высокоорганизованных
молекул,
например
белков
и
пептидов,
а
с
другой

многие
(
автотроДы
)
бактерии
и
отчасти
дрожжи
утилизируют
такие
простейшие
углеродсодержащие
соединения,
как
метан,
метанол
и
даже
углекислота
.

Кроме
углерода
клетки
микроорганизмов
в
процессе
роста
испытывают
необходимость
в
источниках
азота,
ДосДора,
макро
-
и
микроэлементов
.
Все
вещества
этого
ряда
находятся
в
питательных
средах
в
виде
солей,
исключением
являются
лишь
среды,
где
азот
и
ДосДор
могут
усваиваться
растущими
культурами
из
органических
источников,
например
автолизатов
или
гидролизатов
микробного
или
животного
происхождения
.
Строго
паразитические
виды
бактерий
размножаются
только
в
присутствии
нативного
белка
.

Потребность
в
кислороде
и
водороде
бактерии
удовлетворяют
главным
образом
за
счет
поступающей
в
клетку
воды
.
Среды
для
культивирования
микроорганизмов
кроме
соединений,
необходимых
для
процессов
биосинтеза,
должны
включать
и
энергетические
субстраты
.
По
способу
получения
энергии
все
микроорганизмы
делят
на
две
основные
группу
:
хемотроДы
и
ДототроДы
.

ОБОРУДОВАНИЕ, ИСПОЛЬЗУЕМОЕ ПРИ РАБОТЕ С
МИКРООРГАНИЗМАМИ

Оборудование для очистки воды

Качество
воды
имеет
важное
значение
не
только
для
приготовления
питательных
сред,
но
и
для
мытья
культуральной
посуды
.

До
недавнего
времени
такая
вода
приготавливалась
путем
простой
и
двукратной
дистилляции
питьевой
воды
.

В
настоящее
время
наряду
с
традиционными
широкое
применение
получили
методы
очистки
воды
путем
использования
Дизико
-
химических
процессов
обратного
осмоса,
ионного
обмена
и
мембранной
Дильтрации
.
Водопроводная
вода,
используемая
в
качестве
исходной
и
прошедшая
в
этих
установках
через
очистку
обратным
осмосом,
поступает
на
Дильтры
из
активированного
угля,
с
них

на
колонки
с
ионообменными
смолами
и
затем
на
мембранные
Дильтры
с
диаметром
пор
0
,
2
мкм
.
При
необходимости
вода
дополнительно
подвергается
воздействию
мощного
потока
УФ
облучения
.

Для
очистки
воды
подобным
способом
наиболее
часто
применяются
установки
типа
ОВ
-
1
,
состоящие
из
двух
конструктивно
самостоятельных
частей,
допускающих
независимое
использование

ОВ
-
2
и
ОВ
-
3
.
Установка
ОВ
-
2
осуществляет
приготовление
общелабораторной
воды,
превосходящей
по
качеству
очистки
дистиллированную
воду
.
Установка
ОВ
-
3
предназначена
для
получения
пригодной
для
приготовления
питательных
сред
сверхчистой
из
общелабораторной
или
дистиллированной
воды
.

Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды

Приборы
и
аппараты
для
мытья
и
стерилизации
посуды
обеспечивают
выполнение
всех
этапов
технологического
процесса
:

1
)
предварительную
стерилизацию
посуды,
поступающей
из
опыта,
насыщенным
водяным
паром
в
паровых
стерилизаторах
(автоклавах)
;

2
)
предварительное
замачивание
в
водных
растворах
химических
реагентов
(
5
%
растворе
гипохлорита
натрия,
3
%
растворе
перекиси
водорода
и
т
.
д
.
)
;

3
)
полоскание
после
замачивания
холодной
или
слегка
нагретой
водой
;

4
)
мытье
горячим
раствором
детергента
с
низким
пенообразованием
;

5
)
вторичное
полоскание
горячей
водой
;

6
)
Динишное
полоскание
дистиллированной
или
общелабораторной
водой
;

7
)
сушку
в
сушильных
шкаДах
с
принудительной
продувкой
горячим
воздухом
;

8
)
упаковку
и
Динишную
стерилизацию
в
паровых
или
воздушных
стерилизаторах
.

Оптимальным
вариантом
для
мытья
посуды
является
использование
автоматических
моечных
машин
(«Fora
Scientific»,
«Miele»,
«Hotpack
-
Heinicke»
.

Приборы для дозирования, разведения и пробоотбора

В
практике
работ
с
клеточными
культурами
постоянно
возникает
необходимость
массового
дозирования,
пробоотбора
или
разведения
биологически
активных
жидкостей
.
Для
этого
используются
автоматические
или
полуавтоматические
устройства,
называемые
в
различных
источниках
дозаторы
-
дилюторы,
автоматические
пипетки
и
т
.
п
.

Одним
из
основных
требований
к
такого
рода
приборам
является
отсутствие
контакта
между
дозируемым
раствором
и
частями
конструкции
дозатора
.
Данным
требованиям
отвечают
полуавтоматические
шприцевые
дозаторы
и
автоматические
шприцевые
дозаторы,
которые
производят
разведение
или
дозирование
одновременно
по
одному,
двум
и
более
каналам
и
могут
работать
как
в
автоматическом,
так
и
полуавтоматическом
режимах
.

Все
указанные
типы
устройств
предполагают
использование
сменных
наконечников,
которые
могут
подвергаться
паровой
стерилизации
и
повторно
использоваться
.

Пипетки
лабораторные
и
дозаторы
пипеточные
типа
производят
полуавтоматическое
дозирование
биологически
активных
жидкостей
и
поставляются
в
наборах
из
1
-
3
моделей
.
Величина
дозы
задается
пользователем
в
определенном
диапазоне
(
2
-
20
мкл,
20
-
200
мкл,
200
-
1000
мкл)
.

Комплект
дозаторов
может
включать
8
моделей,
каждая
из
которых
обеспечивает
выдачу
2
Диксированных
по
объему
доз
(от
5
до
1000
мкл)
.

Комплект
дозаторов
может
включать
5
моделей,
настроенных
на
1
Диксированную
дозу
(от
20
до
500
мкл)
.

Механические дозаторы лабораторные (автоматические
пипетки):
механический степпер
и
механические дозаторы


Электронные дозаторы лабораторные (автоматические
пипетки электронные)

Описанные
выше
приборы
позволяют
работу
с
жидкостями,
нагретыми
до
40
°
C
и
имеющими
вязкость,
близкую
к
вязкости
воды
.
Тем
самым
не
обеспечивается
дозирование
питательных
сред
на
основе
агара,
которые
для
придания
им
малой
вязкости
должны
быть
нагреты
до
температуры
не
менее
60
°
C
.
В
таких
случаях
используются
приборы
типа
«Агар»
.
Этот
аппарат
для
разлива
питательных
сред,
состоящий
из
перистальтического
насоса
-
дозатора
и
разливочного
механизма,
обеспечивает
автоматическое
одновременное
заполнение
в
течение
1
минуты
16
стеклянных
чашек
Петри
диаметром
100
мм,
находящихся
в
специальных
планшетах
.
Стерильные
условия
в
аппарате
поддерживаются
путем
УФ
облучения
его
внутреннего
объема
.

В
экспериментах
также
применяются
устройства
малой
лабораторной
техники,
не
являющиеся
по
своей
сути
дозаторами,
но
способные
облегчить
этот
процесс
.
Это
так
называемые
приборы
«Pipet
-
Aid»
(Дирмы
«Flow»,
«Bellco»,
«Cole
-
Parer»
и
другие),
предназначенные
для
пробоотбора
и
выдачи
дозы
при
работе
с
пипетками
Пастера
и
любыми
градуированными
пипетками
емкостью
до
75
мл
.
Пипетка
вставляется
в
специальный
держатель,
соединенный
с
малогабаритным
вакуумным
насосом,
находящимся
либо
непосредственно
в
держателе,
либо
автономно
.
Управление
работой
прибора
производится
нажатием
кнопок,
размещенных
на
держателе
.

Устройства для приготовления и стерилизации
питательных сред

Одним
из
главных
требований
к
питательным
средам
для
клеточных
культур
является
их
стерильность,
достигаемая
разными
способами,
включая
и
так
называемую
стерилизующую
Дильтрацию,
освобождающую
жидкие
питательные
среды
от
примесных
частиц,
бактерий
и
коллоидов
.

Под
стерилизацией
сред
обычно
понимают
любой
метод
воздействия,
обеспечивающий
удаление
из
них
микроорганизмов
-
контаминантов
или
разрушение
последних
.

На
практике
главная
цель
стерилизации

достижение
стерильности,
но
сохранение
качества
питательной
среды
также
имеет
важное
значение,
так
как
непосредственно
от
этого
будет
зависеть
результат
процесса
культивирования
.

Длительность
экспозиции,
или
время
выдержки

это
тот
временной
интервал,
в
пределах
которого
погибают
микроорганизмы
.
Гибель
последних
спор
в
среде
является
случайным
процессом,
поэтому
введено
понятие
«
критерий
стерильности»

отношение
числа
операций
стерилизации,
в
результате
которых
выжили
по
одной
термостойкой
споре,
к
общему
числу
проведенных
операций
.
Для
стерилизации
сред
принимают
критерий
стерильности,
равный
0
,
01
±
0
,
001
.

Если
исходное
количество
спор
в
среде
принять
N
0
,
то
получим
соотношение
N/N
0

уровень
стерильности,
или
коэДДициент
выживания
,
который
означает,
что
для
достижения
заданного
критерия
стерильности
(например
0
,
01
)
среда
должна
выдерживаться
при
температуре
стерилизации
строго
определенное
время,
чтобы
«популяция»
спор
снизилась
от
исходного
значения
N
0
до
N/N
0
.

Сыпучие
и
твердые
среды,
используемые
в
настоящее
время
для
получения
Дерментов
поверхностным
методом
и
кормовых
добавок,
стерилизуют
паром,
инДракрасными
лучами
,
а
также
используют
другие
Дакторы
.
Компонентами
таких
сред
являются
отруби,
биошрот,
свекловичный
жом,
древесные
опилки,
солома
.
Компоненты
предварительно
тщательно
измельчают
и
смешивают
в
оптимальных
соотношениях
.

Для
стерилизации
газовых
потоков

первую
очередь
воздуха)
используют
процесс
Дильтрации
через
специальные
Дильтры
с
последовательно
расположенными
Дильтрующими
элементами,
каждый
из
которых
обеспечивает
заданную
степень
снижения
концентрации
клеток
в
газовом
потоке
.
Общее
количество
Дильтров
определяется
необходимым
уровнем
(критерием)
стерилизации
.
Фильтрующий
материал
периодически
стерилизуется
подачей
острого
пара
в
отключенный
Дильтр
через
заданные
промежутки
времени
.

Жидкостные
потоки
стерилизуют
различными
методами,
из
которых
практический
интерес
представляют
термический,
радиационный,
Дильтрационный
и
отчасти
химический
.

Термический
-
самый
распространенный,
при
температурах
порядка
120
-
150
оС
.
Основным
недостатком
термической
стерилизации,
несмотря
на
ее
широкое
практическое
использование,
следует
считать
неизбежные
потери
питательных
свойств
среды,
поскольку
при
температурах,
необходимых
для
стерилизации,
большинство
субстратов,
особенно
углеводы,
оказываются
термически
нестабильными
.

Радиационный
-
γ
-
излучение,
дает
хорошие
результаты
при
стерилизации
небольших
объектов,
однако
применяется
редко
из
-
за
трудностей
эксплуатации
мощных
источников
этого
излучения
.

В
отдельных
случаях
применяют
химические
стерилизующие
агенты
(вещества
с
ярко
выраженным
асептическим
действием)
.
Основная
проблема
в
этом
случае
-
необходимость
устранения
стерилизующего
агента
из
питательной
среды
после
гибели
микроДлоры
до
внесения
инокулята
.
Химические
антисептики
должны
быть
не
только
высокоэДДективны,
но
и
легко
разлагаемы
при
изменении
условий
после
завершения
стерилизации
.
К
числу
лучших
относится
пропиолактон
,
обладающий
сильным
бактерицидным
действием
и
легко
гидролизуемый
в
молочную
кислоту
.

Метод
Дильтрации
является
идеальным
для
стерилизации
термически
неустойчивых
жидких
и
газовых
сред,
поскольку
может
осуществляться
при
низкой
температуре
и
требует
лишь
градиента
давления
по
разные
стороны
мембраны
.
Основная
трудность
-
наличие
термостойких
мембран,
способных
выдерживать
многократную
стерилизацию
их
самих
.

Следует
различать
микро
-
и
ультраДильтрацию
сред
.
При
микроДильтрации
из
жидкости
удаляются
частицы
примесей
и
бактерий
размерами
от
0
,
25
до
10
мкм
.
УльтраДильтрация
приводит
к
извлечению
из
раствора
очень
мелких
частиц
и
коллоидов,
а
также
молекул
растворенных
веществ
с
молекулярными
массами
от
1
тысячи
до
1
миллиона
.

Процесс
микроДильтрации
осуществляется
пропусканием
жидкости
через
мембранные
или
глубинные
Дильтры
.
Для
очистки
питательных
сред
пригодны
мембранные
Дильтры,
производимые
Дирмами
«Millipore»,
«Sartorius»,
«Shleiher
-
Shull»
и
другие
.

В
общем
случае
установка
для
стерилизующей
Дильтрации
состоит
из
системы
создания
избыточного
давления
на
Дильтруемую
жидкость,
стерильного
держателя
Дильтра,
Дильтрующей
мембраны,
трубопроводов
и
сосудов
для
размещения
Дильтруемой
жидкости
и
Дильтрата
.
Величина
избыточного
давления
зависит
от
размера
пор
и
площади
мембраны
.

Ряд субстратов не требует стерилизации, так как они сами
обладают асептическим действием; сюда относят метанол,
этанол, концентрированная уксусная кислота и др. В этом
случае ограничиваются стерилизацией прочих элементов
питательной среды
.

Помещения для работы с культурами клеток

Все
манипуляции
при
работе
с
клеточными
культурами,
проводится
в
боксовых
помещениях
или
в
ламинар
-
боксах
.

Боксовое
помещение
представляет
собой
изолированную
комнату
с
несорбирующими
пыль
моющимися
покрытиями,
имеющую
предбоксник
и
обеспеченную
необходимым
общим
и
специальным
освещением,
системами
приточной
и
вытяжной
вентиляции,
холодным
и
горячим
водоснабжением,
а
также
подводами
газов
и
сжатого
воздуха
.

Альтернативой
боксовым
помещениям,
требующей
меньших
затрат
на
оборудование,
являются
ламинар
-
боксы
или
стерильные
рабочие
места
.
В
этом
случае
в
любом
помещении
может
быть
создан
локальный
стерильный
объем,
необходимый
для
работы
и
создающий
биологическую
защиту
пользователей
.

Разные
типы
ламинар
-
боксов
предназначены
для
размещения
в
любых
помещениях,
имеющих
приточную
вентиляцию
с
грубой
предварительной
очисткой
воздуха
.

Технически
задача
решается
путем
постоянного
обдува
места
проведения
работ
ламинарным
потоком
.
При
работе
с
заведомо
непатогенными
материалами
поток
обеспыленного
воздуха
из
рабочей
зоны
выходит
непосредственно
в
окружающее
пространство
.
В
случае
работы
с
потенциально
патогенным
материалом
воздух
перед
выходом
из
рабочей
зоны
дополнительно
Дильтруется,
возможность
обдува
оператора
при
этом
исключена
.
В
зависимости
от
устройства
ламинар
-
бокса
поток
обеспыленного
воздуха
в
рабочей
зоне
может
быть
горизонтальным,
вертикальным
или
наклонным
.

Ламинар
-
бокс
с
горизонтальным
потоком
обеспыленного
воздуха
обеспечивает
очистку
воздуха,
подаваемого
в
рабочую
зону,
путем
Дильтрации
на
Дильтрах
грубой
и
тонкой
очистки,
встроенных
в
прибор
(по
мере
загрязнения
грубый
Дильтр
промывается,
тонкий
сменяется)
.
Прибор
имеет
встроенные
источники
освещения,
УФ
облучения
(для
стерилизации
рабочей
зоны
в
перерывах
между
использованием
бокса)
и
регулятор
скорости
воздушного
потока
.

Организация
ламинар
-
боксов
с
вертикальным
и
наклонным
потоком
обеспыленного
воздуха
аналогична
организации
ламинар
-
бокса
с
горизонтальным
потоком,
описанной
выше
.

Ламинар
-
бокс
для
работ
с
потенциально
патогенными
культурами
имеет
некоторые
отличия
.
В
приборе
обеспечивается
рециркуляция
воздушного
потока,
заключающаяся
в
том,
что
воздух
из
рабочего
объема
попадает
на
специальный
Дильтр
тонкой
очистки,
откуда
часть
его
выходит
в
окружающее
пространство,
а
остальной
поток
повторно
проходит
через
Дильтр
тонкой
очистки
и
вновь
поступает
в
рабочий
объем
.
Этим
достигается
невозможность
выноса
обрабатываемого
материала
в
помещение
.
Прибор
имеет
встроенные
источники
света
и
УФ
облучения,
столешницу
из
нержавеющей
стали
.
Передняя
часть
рабочего
объема
закрыта
прозрачным
стеклом,
перемещаемым
по
высоте
.
Бокс
снабжен
системой
регулирования
скорости
потока
воздуха
и
индикаторами
загрязнения
Дильтра
тонкой
очистки
.

Оборудование культуральных лабораторий

Лабораторные термостаты

Лабораторные
термостаты
для
культивирования
клеток
должны
отвечать
ряду
специальных
требований
:

1
)
обеспечивать
высокую
стабильность
поддержания
заданной
температуры,

2
)
создавать
минимальный
градиент
температуры
по
полезному
объему,

3
)
обладать
системой
быстрого
восстановления
температуры
после
кратковременного
открывания
полез
-
ного
объема,

4
)
внутренний
объем
должен
изготавливаться
из
биологически
пассивных
материалов,
т
.
е
.
не
влияющих
на
жизнедеятельность
клеток
и
стойких
к
воздействию
компонентов
питательных
сред
.

Материалы
и
покрытия
внутренних
и
наружных
частей
конструкции
термостата
должны
позволять
деконта
-
минацию
растворами
спирта
ректиДиката
и
стерилизацию
УФ
облучением
.

По
своей
конструкции
лабораторные
термостаты
подразделяются
на
жидкостные
и
воздушные
.

В
жидкостных
термостатах
полезный
объем
окружен
емкостью,
заполненной
дистиллированной
водой,
которую
собственно
и
нагревают
.
Жидкостные
термостаты
обеспечивают
малые
значения
температурного
градиента
в
камере,
но
имеют
очень
большую
тепловую
инерцию
и
поэтому
длительное
время
вхождения
в
рабочий
режим
.

Воздушные
термостаты
имеют
полезный
объем,
непосредственно
контактирующий
с
электронагре
-
вательными
элементами
.
Усовершенствованные
Дормы
воздушных
термостатов,
ранее
уступавших
жидкостным
по
ряду
основных
параметров,
теперь
составляют
значительную
часть
серийно
выпускаемых
моделей
.

СО
2
-
инкубаторы

Необходимость
поддержания
постоянной
величины
рН
в
питательной
среде
и
ее
минимального
испарения
в
период
инкубации
клеток
привела
к
разработке
специальных
приборов,
аналогичных
описанным
выше
термостатам
.
Главным
отличием
является
наличие
систем
создания
и
поддержания
определенного
состава
газовой
среды
в
полезном
объеме
и
высокой
относительной
влажности
в
нем
.
Это
так
называемые
углекислотные
инкубаторы,
выпускаемые
Дирмами
«Heraues»,
«Hotpack»,
«Flow»
.

Газовая
среда
в
камерах
СО
2
-
инкубатора
содержит
повышенную
концентрацию
кислорода
и
углекислого
газа,
а
в
большинстве
случаев
только
углекислого
газа
.
Величина
концентрации
задается
по
условиям
культивирования
и
поддерживается
автоматически
.
В
автоматических
СО
2
-
инкубаторах
заданный
состав
газовой
среды
поддерживается
дозированным
поступлением
нужного
газа
в
поток
очищенного
от
пыли
внешнего
воздуха,
подаваемого
во
внутренний
объем
прибора
.

Другой
разновидностью
инкубаторов
являются
так
называемые
газо
-
проточные
инкубаторы,
где
подача
нужных
газов
производится
непрерывно,
а
точное
процентное
содержание
достигается
изменением
скорости
протока
.

Лабораторные встряхиватели

Большое
значение
в
оснащении
культуральной
лаборатории
имеют
приборы,
обеспечивающие
принудительное
перемешивание
питательных
сред
с
помещенными
в
них
микробными
клетками,
обеспечивая
лучший
газообмен,
и,
тем
самым,
повышая
эДДективность
культивирования
.

Большинство
моделей
встряхивателей
позволяет
перемешивание
в
одном
режиме

вращательном
или
возвратно
-
поступательном
.
Хотя
наиболее
современные
модели
(Дирма
«Infors»)
являются
универсальными,
т
.
е
.
работают
в
разных
режимах
перемешивания
.

Лабораторные Дерментеры

Это
комплексы
приборов
и
аппаратов
для
массового
суспензионного
или
глубинного
культивирования
микробных
культур
.

В
общем
случае
Дерментер
состоит
из
культивационного
сосуда,
насосов
и
соединительных
трубопроводов
(для
подачи
питательной
среды,
газов,
инокулята
и
отбора
продукта),
измерительных
приборов
и
регуляторов,
управляющих
температурой
среды
в
сосуде,
ее
рН,
окислительно
-
восстановительным
потенциалом
и
другими
параметрами
.

Биореакторы
должны
удовлетворять
следующим
требованиям
:
полная
герметизация,
исключающая
попадания
посторонней
микроДлоры
;
сохранение
постоянного
объема
культуральной
жидкости,
удобство
при
чистке
всех
частей
аппарата
и
внутренней
поверхности,
а
также
удобство
стерилизации
.

Части
Дерментеров,
контактирующие
с
питательной
средой
(сосуды,
соединительные
трубопроводы,
насосы
и
др
.
),
изготавливаются
из
биологически
пассивных,
химически
стойких
материалов,
позволяющих
производить
стерилизацию
насыщенным
водяным
паром
(качественная
нержавеющая
сталь,
Дторопласт,
боросиликатное
стекло,
силиконовая
резина)
.

Сосуды
Дерментеров
имеют
цилиндрическую
(реже
коническую)
Дорму
.
В
них
размещены
датчики,
а
также
система
для
аэрации
питательной
среды,
производимой
барботированием
газов
(подача
газов
снизу
через
барботер)
или
сочетанием
продувки
газов
с
механическим
перемешиванием
среды
.
При
использовании
механических
мешалок
их
соединение
с
приводным
двигателем
производится
при
помощи
магнитных
муДт,
что
снижает
риск
загрязнения
питательной
среды
.
Помимо
механического
и
пневматического
перемешивания
используются
также
системы
циркуляционного
(гидродинамического)
перемешивания
направленным
током
жидкости
по
замкнутому
контуру
при
помощи
насосов
.

К
важнейшим
Дакторам,
определяющим
устройство
реактора,
относятся
:
агрегатное
состояние
исходных
веществ
и
целевых
продуктов,
а
так
же
их
биохимические
и
микробиологические
свойства
;
температура
и
давление,
при
которых
протекает
процесс
;
тепловой
эДДект
процесса
и
скорость
теплообмена
;
интенсивность
массообмена,
перемешивания
реагентов
;
непрерывность
или
периодичность
процесса
;
удобство
монтажа
и
ремонта
аппаратуры,
простота
его
изготовления
;
доступность
конструкционного
материала
и
т
.
д
.

В
зависимости
от
конструктивных
решений,
объемов
и
других
характеристик
биореакторы
делят
на
группы
.

На
основе
рабочего
объема
биореакторы
делятся
на
лабораторные
(их
емкость
0
,
5
-
100
л),
пилотные
(
100
л
-
10
м
3
)
и
промышленные
(
10
-
100
м
3
)
.
Во
всех
случаях
питательной
средой
заполняется
не
более
75
%
объема
сосуда
.
Все
биореакторы
могут
быть
разделены
по
используемому
принципу
культивирования
на
закрытые
и
открытые
.
В
закрытых
биореакторах
осуществляют
периодическое
культивирование,
иногда
его
называют
накопительным
культивированием
.

По способу подачи воздуха
в
биореактор
их
можно разделить на 2 типа:

без подводки стерильного воздуха
(в таких
биореакторах культивируют анаэробные
микроорганизмы);

с подводкой стерильного воздуха
(их используют
для культивирования аэробов). Аэрация жидкости
в биореакторах может обеспечиваться
механическими мешалками или потоком воздуха.

Ферментеры
можно
подразделить
в
зависимости
от
системы
перемешивания
на
три
основные
группы
:
аппараты
с
механическим,

барботажным,

эрлиДтным
перемешиванием
.

Биореакторы
с
механическим
перемешиванием
характеризуются
тем,
что
воздух
подают
под
давлением
через
распределитель,
представляющий
собой
кольцо
с
множеством
маленьких
отверстий
.
При
этом
образуются
мелкие
пузырьки
воздуха
и
за
счет
механического
перемешивания,
обеспечивается
их
равномерное
распределение
внутри
аппарата
.
Для
этой
же
цели
используются
мешалки,
которые,
разбивая
крупные
пузырьки
воздуха,
разносят
их
по
всему
реактору
.
ЭДДективность
распределения
воздуха
зависит
от
типа
мешалки,
числа
ее
оборотов
и
Дизико
-
химических
свойств
используемой
среды
.
При
интенсивном
перемешивании
часто
случается
вспенивание,
поэтому
рабочий
объѐм
биореакторов
такого
типа
не
превышает
55
%
.

Биореакторы
с
барботажной
системой
воздухораспределения
характеризуются
тем,
что
перемешивание
в
них
осуществляется
восходящими
потоками
воздуха,
который
подают
под
высоким
давлением
в
нижнюю
часть
биореактора
через
барботеры
,
представляющие
собой
воздушные
трубы
с
отверстиями
диаметром
0
,
1
-
0
,
2
мм
.
Подача
воздуха
под
сильным
давлением
приводит
к
сильному
пенообразованию,
поэтому
рабочий
объем
биореакторов
такого
типа
также
не
превышает
55
%
.

Биореакторы
с
эрлиДтной
системой
воздухораспределения
характеризуются
тем,
что
воздух
подают
через
центральную
трубу,
которая
обеспечивает
внутреннюю
циркуляцию
жидкости,
либо
за
счет
внешней
системы
циркуляции,
которая
осуществляется
также
с
помощью
труб,
установленных
снаружи
аппарата
.

По
конструкции
биореакторы
классиДицируются
следующим
образом
:

реакторы
емкостного
типа
;

реакторы
типа
колонны
;

реакторы
трубчатого
типа
;

реакторы
пленочного
типа
;

реакторы
мембранного
типа
;

реакторы
с
псевдоожиженным
слоем
.

Конструктивный
тип
реактора
зависит
от
условий
проведения
процесса
и
свойств
участвующих
в
нем
компонентов
.

КлассиДикация
Дерментеров
по
способу
подвода
энергии
:

Ферментеры
с
подводом
энергии
газовой
Дазой
(группа
ФГ)
.
Их
общий
признак

подвод
энергии
в
аппарат
через
газовую
Дазу,
которая
является
ее
носителем
.
Ферментеры
характеризуются
достаточно
простой
конструкцией
(отсутствуют
трущиеся,
движущиеся
узлы),
высокой
эксплуатационной
надежностью,
но
имеют
не
очень
высокие
массообменные
характеристики
.
Данные
аппараты
представляют
собой
вертикальную
емкость,
снабженную
газораспределительным
устройством
одного
из
известных
типов
.

К
таким
аппаратам
относятся,
например,
барботажные
и
эрлиДтные
Дерментеры
.

Ферментеры
с
вводом
энергии
жидкой
Дазой
(группа
ФЖ)
наиболее
сложны
по
конструкции
и
энергоемки,
но
обеспечивают
наиболее
высокие
по
сравнению
с
группой
Дерментеров
ФГ
значения
коэДДициента
массопередачи
кислорода
.

В
данных
аппаратах
ввод
энергии
осуществляется
жидкой
Дазой,
обычно
самовсасывающими
мешалками
или
насосами
;
в
последнем
варианте
жидкость
вводится
в
аппарат
через
специальное
устройство
(сопло,
эжектор,
диспергатор)
.
Данные
аппараты
также
можно
подразделит
на
типы
:

Дерментеры
с
самовсасывающими
мешалками
не
требуют
специальных
воздуходувных
аппаратов,
так
как
поступление
в
них
воздуха
происходит
в
результате
разрежения
в
воздушной
камере
мешалки,
соединенной
с
воздуховодом
и
с
жидкостью,
отбрасываемой
лопатками
мешалки
;

в
эжекционных
Дерментерах
возможна
рециркуляция
газовой
Дазы,
что
экономит
субстрат,
однако
требуется
наличие
специальных
насосов
для
перекачки
газосодержащей
культуральной
среды
.

Применение
эжекционного
ввода
газовых
субстратов
в
Дерментер
может
интенсиДицировать
массообмен
на
порядок
;

струйные
Дерментеры

затопленной
или
падающей
струей)
оборудуются
мощными
насосами,
которые
забирают
культуральную
жидкость
из
нижней
части
аппарата
.
Струя
жидкости
под
давлением
свободно
падает
сверху
и
пронизывает
аэрируемую
жидкость
до
дна
аппарата,
интенсивно
перемешивая
жидкость
.
Внизу
жидкость
вновь
засасывается
насосом
и
снова
подается
вверх
аппарата,
то
есть
возникает
замкнутый
контур
циркуляции
.

Недостатком
данных
аппаратов
являются
потери
энергии
при
перекачке
жидкости,
трудности
проектирования
в
связи
с
отсутствием
надежных
методик
расчета
конструкций
и
режимов
работы
струйных
и
эжекционных
устройств
.

Третья
группа
аппаратов

с
подводом
энергии
газовой
и
жидкой
Дазами
(группа
ФЖГ)
.
Основными
их
конструкционными
элементами
являются
перемешивающие
устройства
всех
известных
типов,
обеспечивающие
высокоэДДективное
диспергирование
и
гомогенизацию,
а
также
наличие
в
совокупности
насосов
и
перемешивающих
устройств
.

Это
могут
быть
аппараты
с
группой
самовсасывающих
мешалок
и
насосом
для
перекачивания
культуральной
жидкости,
высокоинтенсивные
аппараты
с
механическим
перемешиванием
и
одновременно
барботажем
сжатым
воздухом
и
другие
сочетания
перемешивающих
и
аэрирующих
устройств
.
КоэДДициент
массопереноса
кислорода
в
таких
Дерментерах
может
в
принципе
иметь
любые
из
известных
значения
.
Рис. Упрощенные схемы биоректоров различных типов
А

реактор
с
механическим
перемешиванием
;
Б

барботажная
колонна
;
В

эрлиДный
реактор
с
внутренней
циркуляцией
;
Г

эрлиДный
реактор
с
внешней
циркуляцией
.
Стрелки

направление
потока
культуральной
среды
.
Ферментеры с вводом энергии жидкой Дазой (группа ЖФ)
а)
с
самовсасывающей
мешалкой
:
1

корпус,
2

мешалка,
3

циркуляционный
контур
-
теплообменник
;
б)
эжекционный
:
1

корпус,
2

насос,
3

эжектор,
в)
струйный
с
затопленной
струей
:
1

эжектор,
2

теплообменник,
3

корпус,
4

насос,
5

рассекатель,
6

труба
с
насадкой,
г)
струйный
с
плавающей
струей
:
1

теплообменник,
2

насос,
3

корпус,
4

эжектор
.
Ферментеры с подводом энергии газовой Дазой (группа ФГ)
а)
барботажный
: 1

корпус, 2

воздухораспределитель,
3

карман, 4

коллектор.

б) барботажный колонный: 1

корпус, 2

рубашка, 3

воздухораспределитель,

в) барботажно
-
эрлиДтный: 1

корпус, 2

диДДузор
-
теплообменник, 3

воздухораспределитель

Известны
следующие
основные
типы
аппаратов
отечественного
производства
:
барботажный
(трубчатый
и
коробчатый),
эрлиДтный
(типовой),
эрлиДтно
-
периДерийный,
эрлиДтно
-
многозонный,
многозонной
конструкции,
колонный,
горизонтальный
с
самовсасывающими
мешалками,
эжекционный,
дрожжерастильный
и
другие
.
Из
зарубежных
моделей
известны
аппараты
Дирм
«ЛеДрансуа»
(Франция),
«Хепос»
(Чехия)
и
«Уде
-
Хекс»
(Германия),
концернов
«
ICI
»
и
«БП»
(Великобритания),
колонный
аппарат
Дирм
«Мицубиси»
(Япония)
и
«Ликвихимик
биосинтез»
(Италия),
струйный
аппарат
«ИЦ»
(Германия),
аппарат
системы
«Фогельбуша»
(Австрия),
шаровой
аппарат
Дирмы
«Хемап»
(Швейцария)
и
другие
.

Большинство
перемешиваемых
и
аэрируемых
культур
во
время
роста
образуют
довольно
много
пены
.
Образование
на
поверхности
среды
культивирования
слоя
из
пузырьков
связано
с
наличием
в
среде
поверхностно
-
активных
веществ
(ПАВ),
Умеренное
пенообразование
способствует
росту
многих
аэробных
микроорганизмов
(пенный
слой

кислородный
коктейль)
.

Особое
внимание
уделяется
борьбе
с
избыточным
пенообразованием,
так
как,
если
не
препятствовать
этому,
пена
смачивает
Дильтры
для
стерилизации
воздуха,
что
приводит
к
контаминации
культуры
посторонней
микроДлорой,
уменьшению
полезного
объема
биореактора,
а
также
выходу
пены
наружу
.

Контроль
пенообразования
осуществляется
путем
введения
в
сосуд
специального
датчика
.

Для
борьбы
с
избыточным
пенообразованием
используется
механическое
и
химическое
пеногашение
.
При
механическом
пеногашении
лопасти
пеногасителя
размещаются
на
валу
мешалки
.
При
химическом
пеногашении
в
крышке
сосуда
предусматривается
специальный
ввод
для
реагента
гашения
.

Химические
пеногасители
более
дешевы,
их
используют
время
от
времени
при
необходимости
подавления
пенообразования
.
Однако
при
добавлении
этих
веществ
может
изменяться
состав
питательной
среды
.

Пеногасящие
вещества
растительного
(кукурузное,
касторовое,
соевое,
подсолнечное
масло,
масло
из
семян
хлопчатника
и
другие)
и
животного
(свиной,
говяжий,
бараний,
китовый
и
другие
жиры)
происхождения
могут
служить
микроорганизмам
источником
углерода
и
энергии
и,
следовательно,
стимулировать
их
активное
развитие
.
Однако
известны
случаи,
когда
природные
пеногасители
оказывали
отрицательное
действие
на
метаболизм
клетки
.

А
такие
неметаболизируемые
пеногасители,
как
силиконы,
в
высокой
концентрации
токсичны
.

Поэтому
пеногасители,
являющиеся
поверхностно
-
активными
веществами,
следует
использовать
только
в
очень
низких
концентрациях
и
только
после
тщательной
проверки
.
Пеногасители
добавляют
непосредственно
в
среду
перед
стерилизацией
или
в
Дерментер
через
специальный
ввод
.

Аппараты
для
анаэробных
процессов
достаточно
просты
и
применяются
в
процессах
конверсии
растительного
сырья,
а
также
различных
промышленных
отходов
.

При
метановом
брожении
для
получения
биогаза,
а
также
в
ряде
других
процессов
(получение
ацетона,
шампанских
вин)
используют
Дерментационные
аппараты
(
метанотенки
)
.

Эти
аппараты
имеют
различную
конструкцию
(от
простой
выгребной
ямы
до
сложных
металлических
конструкций
или
железобетонных
сооружений)
и
объемы
(от
нескольких
до
сотен
кубометров)
.
Метанотенки
оборудованы
системой
подачи
сырья,
системой
теплообменных
труб
для
стабилизации
температуры,
несложным
перемешивающим
устройством
для
гомогенного
распределения
сырья
и
биомассы
продуцента,
газовым
колпаком
и
устройством
переменного
объема
(
газгольдер
)
для
сбора
образуемого
биогаза
.

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ПОСУДА

Для
культивирования
клеток
обычно
используют
Длаконы,
колбы,
матрасы,
чашки
Петри,
платы,
роллерные
сосуды,
пробирки,
пипетки
и
т
.
д
.

Посуда из стекла

В
последние
годы
посуда
из
стекла
не
утратила
своего
значения,
благодаря
ряду
бесспорных
преимуществ
:

хорошие
адгезионные
свойства
поверхности
;

многократность
использования
;

биологическая
инертность
стекла
ряда
составов
;

термостойкость
и
другие
.

Кроме
того,
в
экспериментах
с
контролируемым
уровнем
кислорода
необходимо
пользоваться
именно
стеклянной
посудой,
т
.
к
.
в
пластике
кислород
может
растворяться
.
Помимо
этого
из
пластика
могут
экстрагироваться
водорастворимые
органические
соединения
.

Для
стеклянной
лабораторной
посуды
на
практике
в
основном
применяются
два
типа
составов

многощелочное
и
малощелочное
.
Щелочесодержащие
силикатные
стекла
имеют
недостаточную
термостойкость
и
химическую
устойчивость
к
воде,
кислотам
и
щелочам
.
Алюмоборосиликатные
малощелочные
стекла
типа
«Пирекс»
характеризуются
высокой
устойчивостью
к
воде,
устойчивостью
к
щелочным
растворам
и
ко
всем
кислотам
за
исключением
плавиковой
(Дтористоводородной)
и
горячей
ДосДорной
.
Кроме
того
стекла
типа
«Пирекс»
обладают
хорошими
оптическими
свойствами
.

Однако
успех
в
эксперименте
обеспечивается
не
только
качеством
стекла,
но
и
степенью
подготовки
лабораторной
посуды
.
Посуда
для
культивирования
должна
быть
чистой
Дизически,
химически
и
биологически
.

Пластиковая посуда

Начиная
с
1965
года,
все
большее
применение
в
лабораторной
практике
находит
пластиковая
посуда
одноразового
использования
.
Такая
посуда
проста
в
использовании,
т
.
к
.
выпускается
в
стерильном,
готовом
к
работе
виде
.
Стерилизация
производится
в
процессе
изготовления
Дизическими
(облучение
УФ
светом
или
гамма
лучами)
или
химическими
(газы

окись
этилена,
жидкости

этиловый
спирт,
раствор
пергидроля)
способами
.

Пластиковая
посуда
производится
в
двух
модиДикациях

для
культивирования
микроорганизмов
и
для
культивирования
клеток
.

Приложенные файлы

  • pdf 18335252
    Размер файла: 3 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий