шпоры БТ


1 Основные предпосылки возникновения биотехнологии.
1)проблема антропогенного загрязнения окр среды. Согласно существующим расчетам предельная величина антропогенного воздействия на биосферу связанная с техич.деятельностью ч-ка не должна превышать 1% от ее полной производительности. В 70гг 20в эта велич составляла 10%. Биосфера саморегулируемая система, поэтому если превысить предельные возможности саморегуляции, то в биосфере начнуться необратимые процессы. В чем выражается воздействие на биосферу: -выделение большого количества СО2, в результате работы энергетич установок и произв.предпр. –возрастает колич-во отходов выбрасываемых в биосферу.
2)недостаток пищевых вещ-в (Белка), вызванный ростом народонаселения, дефицит чистой воды. Пища насел. Промышлен развитых стран общая масса белка 90г, в том числе животного 44г в сутки на чел-ка. В развиввающ странах населен получ 58г белка в т.ч 9г животного. 3)нарастает дефицит как энергет так сырьевых ресурсов. 4) проблема ухудшения состояния здоровья населения и необходимость развития новых средств диагностики и лечения. 5) развитие отдельных направлений в биологии, в частности биохимии, молек биологии, биофизики, генетики, что позволяет на их основе создавать биотехнологии способные решать вышеназваные проблемы.
2.Понятие биотехнология. Термин биотехнология был введен в 1917г венгерским инженером Карлом Иреки. При описании процесса выращивания свиней с использованием корма- сах свеклы. Согласно нему Биотехнология – все виды работ, при котороых из сырьевых материалов с помощью энерг организмов производится те или иные продукты. Этот термин в те годы не получил широк распространения. В 1961 к нему вернулись после того как шведский биолог Карл Герн-Хеден порекомендовал изменить название научного журнала по биохимии и биол. инженерии и технологии на название биотехнология и биоинженерия. В настоящее время БТ понимается не однозначно, существует широкое узкое и среднее его толкование. Узкое: Биотехнология- ограничена генно-инженерн. манипуляциями. за предел БТ остается промышленные микробиологические производства.
Широкое: БТ-все технологические процессы, в которых используются все живые организмы. При таком понятии вся с/х –биотехнология.
Если отказаться от обеих позиций, то БТ можно определить по ее основному признаку – возможностью управления биотехнологическими объектами. Биотехнология- направление научно-технического прогресса, использующая биотехнологические процессы и агенты для целенаправленного воздействия на природу и промышленное получение продуктов в конкретных условиях.

3.История возникновения и развития биотехнологии. Классификация Еринова: 1й- имперический с 6века до н.э до половины 19 века. С древнего времени человек использовал живые организмы (микроорганизмы) не зная о их существован. 1-м микробиологическим процессом было брожение – процесс обмена веществ, при котором в биологическом субстрате происходит изменение под воздействием микробных ферментов. Применяют при хлебопечении, пивоварении, виноделии. С 3-4 тыс до н.э известны процессы брожения лежащие в основе мочки прядильных растений (волока конопли).
Во второй половине 15в начинается развитие естествознания. Произошел сдвиг в понимани брожения, появилась ферментация, процессы брожения связывали с наличием дрожжей или их ферментов. С 16-17 веков стали использовать пивные дрожжи для разрыхления теста. В 18 веке изучалось способность ферментов к катализу хим.рекции. в рез-те развития описательной микробиологии и изучения хим.превращений стали предпосылкой для становления биохимии. В 19в в химии заложени основы органич.химии, открыты органические кислоты.
2-й- Этиологический(научный) со второй полов19вдо 1/3 20в. Луи Пастер: доказал, что заболевание порча продуктов, гниение, брожение вызываются МО. Создал теорию об экзогенности. Научные теории пивоварения, виноделия, борьба с болезнями. Усовершенствовали среду для выращивания МО. В результате стали применять чистые культуры. Микробиологический антогонизм применяют в медицине.(Мечников). 70-80 гг 19в заложены основы культивирования растит клеток и жив-х. в основу положенны работы: клеточная теория Шванна и Виркова. Открытия законов менделя, которые легли в основу генетики. Т.обр внедрение научных знаний дало возможность приступить к разработке биотехнологий.
3-й-биотехнологический (с 1933-1972) внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметического оборудования, обеспечивающего протекание многих процессов в стерильных условиях. В 1933г Клюйвер и Перкин опубликовали работу по изучению обмена у плесневых грибов, в которой изложили технич приемы их глубинного культивирования. В этот период стали выпускать биоудобрения и биолог препаратыдля борьбы с вредителямии болезнями с/х растений. Революционным моментом была промышленная реализация производства антибиотиков. Отправной точкой послужило открытие Флемингом химико-терапевтического действия пеницилина. В СССР Ермолаева показала что лизоцим является фактором естественного иммунитета. Биотехнологич организованы массовое производства аминокислот, белка, превращения стероидов , культуры кл МО-для производства вакцин. В конце 60х гг разработали и стали использовать технологию иммобилизации ферментов.
4-й генно-инженерный период. 1972 в США Бергом была создана 1-я рекомбинантная молекула ДНК. Возникла генная инженерия. В 1973 г Коэн и Бойр получили рекомбинантные плазмиды и провели им трансформацию кл кишечной палочки. В течении 4х лет после открытия рекомбинантной ДНК появились штаммы бактерий продуцирующих инсулин и человеческий гормон роста.

4 Объекты биотехнологии и их биотехнологические функции
Биотехнологические объекты находятся на разных ступенях организации:
а) субклеточные структуры (вирусы, плазмиды, ДНК митохондрий и хлоропластов, ядерная ДНК);
б) бактерии и цианобактерии; в) грибы; г) водоросли;
д) простейшие;е) культуры клеток растений и животных;
ж) растения – низшие (анабена-азолла) и высшие – рясковые.
Микроорганизмов, синтезирующих продукты или осуществляющих реакции, полезные для человека, несколько сотен видов. Биотехнологические функции бактерий разнообразны. Бактерии используются при производстве: - пищевых продуктов, например, уксуса, молочнокислых напитков (Lactobacillus,) и др.; - микробных инсектицидов (Bacillus); белка; - витаминов (Clostridium - рибофлавин); - растворителей и органических кислот; - биогаза и фотоводорода.Широко используется такое свойство некоторых бактерий, как диазотрофность, то есть способность к фиксации атмосферного азота. Бактерии также широко используются в генноинженерных манипуляциях при создании геномных клонотек, введении генов в растительные клетки (агробактерии). К грибам относятся дрожжи и плесени. К дрожжам, сбраживающим лактозу, относится Kluyveromyces fragilis, который используют для получения спирта из сыворотки. Плесени вызывают многочисленные превращения в твердых средах, которые происходят пред брожением.
Пищевые продукты на основе сброженных плесневыми грибами Rhizopus oligosporus соевых бобов или пшеницы содержат в 5 - 7 раз больше таких витаминов, как рибофлавин, никотиновая кислота) и отличаются повышенным в несколько раз содержанием белка. Плесени также продуцируют ферменты, используемые в промышленности (амилазы, пектиназы и т.д.), органические кислоты и антибиотики. Их применяют и в производстве сыров, например, рокфора.
Простейшие относятся к числу нетрадиционных объектов биотехнологии. До недавнего времени они использовались лишь как компонент активного ила при при биологической очистке сточных вод. В настоящее время они привлекли внимание исследователей как продуценты биологически активных веществ. Водоросли используются, в основном, для получения белка. Весьма перспективны в этом отношении и культуры одноклеточных водорослей, в частности высокопродуктивных штаммов рода Chlorella и Scenedesmus. Их биомасса после соответствующей обработки используется в качестве добавки в рационы скота, а также в пищевых целях.
Растения в биотехнологии Водный папоротник азолла ценится как органическое азотное удобрение, Рясковые служат кормом для животных, для уток и других водоплавающих птиц, рыб, ондатры. Их используют и в свежем, и в сухом виде как ценный белковый корм для свиней и домашней птицы.

5.Основные направления развития биотехнологии. 1)БТ в медицине: генная инженерия, на которой основана генная терапия( исправления врожденных дефектов кл и организма человек путем введения в кл нормального генетического материала) известно более 4000 наслед заболеваний.
-фармакология: Антибиотики — самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками.
2)С/Х биотехнология : -производство биоудобений и биопрепаратов для борьбы с вредителями; - Биологическая азотфиксация; - использование кл и тканей с целью ускорения и облегчения селекционного процесса и для криосохранения целых генотипов. – разработка биопестицидов, и др препаратов избирательно действующих на с/х культуры и безопасны для человека. –создание исходных материалов и на его основе сортов с/х культур.
3) БТв пищевой и молочной промышленности: - получение пищевого белка, - производство кисломолочных продуктов, -получение сахарозы и ее заменителей, - производство пищевых кислот (уксусная, лимонная, молочн), -дрожжи и продукты дрожжевого брожения( хлебобулочные, пивные дрожжи, пиво, вино)
4)биоэнергетика и биотехнология: -производство энергии из биомасссы с помощью МО, - производство биогаза, - производство жидкого топлива (этил. Спирт), -дополнит источник металлов (путем выщелачивания) в 90е годы пятая часть добычи меди путем выщелачивания из горных пород.
5)Экологическая: -повышение экологической чистоты различных производств путем снижения массы отходов, - биологическая очистка сточных вод, -биологическое разложение ксенобиотиков и токсических веществ, рекультивация почв.
6)Биоэнергетика: -для создания улучшеных типов биосесоров и новых приводящих устройств – биочипы (на поверхности электродов наносят к-либо МО или биологическ.ткань, которая является датчиком биолог и используется для определения концентрации уксусной кислоты. В качестве сенсоров моноклональные антитела, которые обладают высокой избирательностью. Производство биогаза путем метанового «брожения» отходов
6. Основные этапы биотехнологических процессов: приготовление питательных сред. Среда должна иметь оптемезированный под выращиваемую культуру состав и содержать все необходимые для нее компоненты. Состав: а) источники углерода – СО2, метан, вводятся в биореактор по определенной линии. Подаются по мере расходования. б) источники азота и фосфора – минеральные соли; в) источники макроэлиментов; г) источники микроэлиментов. Условия: соблюдение асептики, потдержание определенного рН, стерильность биореактора, подача минеральных и газообразных веществ через фильтры, спирт подается баз стерилизации .
Способы стерилизации питательных сред: а) термический: 120градусив С, под давлением; б) радиационный: используется если термический невозможен, дорогой, в основном применяется в мед. отрасли; основан на облуч-и матер-в больш. дозами ионизир. излуч.-гамма излуч. в) химический: чаще используют при малых производствах, необходимо подбирать вещество не токсичное для выращиваемой культуры; в-ва с сильн ассептич. дей-м. проблемы: усранение стериал. агента из пит. среды после гибели постор. микрофлоры и донесение инокулята продуцета. После стериализ-и хим. агенты долж. легко раз-я. Пропиолактон-сильное бактерицид. в-во. г) фильтрация: дорогой за счет того что необходимо менять фильтры.
7. Основные этапы биотехн-ких процессов: поддержание чистой культуры.
В лабораторном отделении чистой культуры проводят:
а) поддержание и хранение штампа продуктов;
б) контрольный высев;
в) маломасштабные ферментации
Все биотехнологические процессы можно разделить на: а) периодические процессы культивирования - подготовка определенной группы клеток к каждой операции; б) непрерывные процессы культивирования – необходимо через определенное время вносить штаммы инакулята.Служба микробиологического контроля при отборе штаммов проверяет их на устойчивость к фаголизису, чистоту реакторов, отслеживает все условия культивирования. Время генерации 15-20 мин. Для анализа необходимо наблюдать за морфологией клетки. Слабое место для биотехнологии – отследить состав культуры в определенный момент. Смена штаммов происходит при смене сырьевой базы. Необходима оптимизация условий культивирования.Нарушение условий чистой культуры м\о снижает экономич., технологич. показатели биотехнологич., производства, а в нек.случаях становится эксплуатация штамма. Поэтому при биотех.производстве существ. Лаборатории чистой культуры , котор. Решают ряд задач: 1.поддержание и хранение штаммов и продуктов , котор.рекоменд.к промышленному применению. 2 . первонач. Отбор штамма для технол. Производства с учетом его особенностей , котор., могут отразиться на экономии этого производства. (устоичивость к мутац. воздействиям ,фаголизису,к изм. Темпер и ph.) 3. Оптимизация типа среды для данного штамма и усл. выращивания. Подборка для конкр.субстрата и среды , штаммы, продуцент. Нужно учитывать сезонные изменения сырья. 4 .проведение контрольных высевов и маломасштаб.ферментаций, наработка инокулята в количествах необх для начала процесса.

8. Основные этапы биотехнологических процессов: ферментация.
Ферментация - вся совокупность последовательных операций от внесения в пит среду инакулята до завершения процессов роста, биосинтеза и биотрансформации вследствие элементов питательной среды или потери активности культуры. Осуществляется в б.х. реакторе (ферменторе) Проблемы асептики иногда решают подбором оптимальных условий обитания или созданием технологии исключающей заражение.
Биореактор – прибор осуществляющий перемешивание культуральной среды. Проблема отвода лишней температуры решается посредством теплообменников. В биореактор подается вода с определенной скоростью, регулируя которую регулируют температуру. Так же необходимо регулировать скорость мешалки для предотвращения осаждения микроорганизмов на теплообменнике. Существуют различные способы ферментации: аэробн-я и анаэробная,переодическая и непрерывная, глубинная и поверхностная. В пром.БТ выделяют 2гр процессов по типу целевого продукта:1гр-получение биомассы самого продуцента, 2гр-получение прод метаболизма культивируемых к-к. 1-й способ отличается от второго т.к. биомасса м.о. производится непрерывно, а прод метаболизма периодическим способом. При периодическоп процессе все компоненты вносят в начале ферментации затем добавляют только О2 ,пеногаситель и к-ту либо основание для контроля ph. Выращиваемая культура в таком процессе проходит 4стадии:1)лаг-фаза;2)экспоненциальная фаза3)стационарная фаза4)фаза отмирания. Целевые прод об-ся в экспоненциальной фазе(первичные метаболиты),либо в стационарной(вторичные метаболиты).недостатки такой ферментации:1)большая затрата времени,связана с загрузкой и разгрузкой биореактора;2)большая затрата из-за малой производимости, исчерпание субстрата;3)необходимость отделения прод от микр.к-к. 4)длительность самого процесса. Непрерывная проточная ферментация. Осуществляется в условиях установившегося режима,когда микробн.популяция и ее прод однородны.Используется для получения биомассы дрожжей,этанола, очистки сточных вод и т.д. Протекает с большой скоростью и высокой плотностью к-к на протяжении всей ферментации, при этом конечный прод должен постоянновыводиться из системы. Преимущества передпериодической:1)более низкозатратная,2)позволяет лучше контролировать процесс ферментации,3)оч.высоко продуктивная. Сист-ма непрерывной ферментации основана по принципу полного вытеснения или полного смешения. В первом случае используется тубулярный реактор полного вытеснения-длинная труба в кот поступают прод пит среды и инокулят а с др стороны уходит культуральная жидкость.При полном смешении исползуют хемостаты-гомогенноеперемешивание что обеспечивает одинаковые условия в разныхместах ферментативного аппарата.

9. Основные этапы биотехнологических процессов: выделение и очистка продукта; товарные формы продуктов.
Стадии: 1. Обделение биомассы продуцента от жидкой фазы методом фильтрования на барабанных вакуумных фильтрах.
2. сНятие биомассы с фильтра и ее пресирование. Рассмотрим на примере производства дрожжей. При производстве дрожжей фильтры не приемлемы, поэтому для них сначала производят спорализацию, а потом выпаривают на вакуумной сушке. При их использовании в качестве белка не должно быть живых клеток (применяют температуру в 60 градусов).
Сложно выделять аминокислоты, белки, антибиотики, ферменты. Биомассу осаждают; если продукт метаболизма находиться в жидкой среде то ее соответственно и используют для его выделения; если в клетках, то их предварительно разрушают. Метод: 1) Механический - растирание и выделение согласно структуре вещества.
2) Химический – разрушение клеточной стенки ферментом или кислотой и выделение веществ. Ферменты выделяют высаливанием, осаждением, экстракцией. Аминокислоты – кристолизацией и т. д.
Мембранной технологией можно получить до 90% всего, что находится в исходной жидкости. Требование чистоты выделения наиболее важно в медицине. Тут используют метод иммобилизации моноклональных антител.
Основные группы товарных форм био препаратов:
1) должны иметь в товарном продукте в качестве основных компонентов жизнеспособные микроорганизмы (закваски, биопестициды, препараты используемые в охране окружающей среды);
2) в системе имеют инактивированную массу клеток и продукты ее переработки (дрожжи, грибной мицелий – используют как заменитель мяса);
3) препараты на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов. Например: жидкий концентрат лизина – в культуральной среде содержится много витаминов. В сухом виде – белково–витаминный концентрат. Получают путем упаривания жидкости пляс добавляют клетки кормовых дрожжей. Важной отраслью является получение спор бактерий паразитирующих в кишечнике насекомых – паразитов. Фасовка – заключение препарата в тару: мешки, ампулы, целлофан, стекло, тетропак. Здесь важна стерильность и герметичность. Для предотвращения слеживания спор добавляют такие вещества как целлюлозу. При производстве кристаличаских аминокислот их выпуск осуществляется в жидком виде.

10. Генетического конструирования микроорганизмов: мутагенез и методы выделения мутантов.
В живой клетке одновременно синтезируется множество соединений.Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма.
Сверхсинтез может быть осуществлен двумя путями:
1) путем спонтанного изменения генетической природы организма in vivo. Селекция (то есть направленный отбор) из природных высокопродуктивных штаммов может занимать годы;
2) путем индуцированного мутагенеза. Метод основан на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (таких как, азотистая и др), ультрафиолетовых и рентгеновских лучей.
Генетическое конструирование in vivo включает получение и выделение мутантов, и использование различных способов обмена наследственной информацией живых микробных клеток. Важнейшим методом селекции м/о является отбор мутантов, т. е. организмов с измененными наследственными признаками, которые появляются в результате мутаций. Различают мутации:
1.Цитоплазматические – затрагивающие внехромосомные генетические детерминанты, с материалом у эукариот – в митохондриях, у прокариот – в плазмидах;
2 Ядерные или хромосомные – затрагивают изменение числа хромосом. Ядерные делятся на 3 типа:
1 – изменение числа хромосом; 2 – изменение числа и порядка расположения генов (структурные мутации); 3 – внутригенные мутации.
В селекции м/о основное значение имеют 2 последних типа. Структурные мутации:
1 делеции – выпадение участков хром;
2 дупликации – удвоение генов;
3 амплификации – умножение числа отдельных генов или групп генов; 4 транслокации – обмен участками между хромосомами;
5 транспозиции – вставка участка хром. в новые места;
6 инверсии – изменение порядка расположения генов на хромосоме. Внутригенные мутации (изменяют последовательность оснований ДНК в пределах одного гена):
1 транзиции – замена 1 основания;
2 трансверсии - замена пуриновых оснований;( в клетках такого типа мутанта синтезируется неактивный белок с измененной последовательностью аминокислот);
3 реверсия – возвращение к дикому типу(в ДНК восстанавливается исходная последовательность оснований).
Реверанты – мутанты, вернувшиеся к дикому типу могут быть спонтанными, индуцированными. Спонтанные, неконтролируемые мутации возникают с низкой частотой Для обнаружения спонтанных мутаций используют селективные среды, индикаторные (когда невозможно провести прямой отбор мутантов) среды. Так изучают морфологию клеток, сдвиг рамки считывания. В качестве тест – культур используют ауксотрофы, дающие рост в том случае, если мутанты выделяют в среду искомый метаболит, а так же чувствительные культуры, рост которых подавляется, если мутант продуцирует антибиотик. В этом случае по зоне роста или зоне ингибирования роста тест – культуры можно говорить о продуктивности мутанта.
Получение ауксотрофных мутантов с помощью метода отпечатков может быть облегчено, если обогащать ими популяцию клеток, используя пенициллин или его аналоги. Эти антибиотики убивают только растущие клетки. Ауксотрофы дают высокий выход продукта. Для повышения частоты мутаций м/о подвергаются физиологическому воздействию ультрафиолетовые волн (индуцированный мутагенез). Применение мутагенов (УФ) повышает частоту мутаций в 100- 1000 раз. Для E. Coli выделение пролина в среду в том
11. Генетическое конструирование микроорганизмов: гибридизация эукариотических м/о, слияние протопластов.
В природе более 2-х клеток не сливаются. Генетическая рекомбинация перераспределяет гены или их части и позволяет объединять в одном геноме признаки 2 х организмов и более. В результате образуются гибридные клетки, сочетающие свойства родительских форм. К рекомбинации ведут различные процессы обмена наследственной информации. живых клеток: половой и парасексуальный процессы у эукар -х м/о, конъюгация, трансдукция; трансформация у прокариот. В опыты по гибридизации обычно берут ауксотрофных мутантов. Метод используется для объединения ген –ой информации дрожжей грибов, водорослей. Образование гибридов происходит в результате слияния клеток. Если исходные клетки были гаплоидными (1 набор хромосом),то в результате слияния ядер появится диплоидная клетка (2 набора хром – м в 1 ядре) Далее происходит мейоз . Затем формируются гаплоидные половые споры, каждая содержит новый набор генов, которыми различались родительские клетки. У дрожжей- сахаромицетов мейоз и образование гаплоидных половых спор происходит лишь в специальных условиях. Если после слияния клеток ядра не сливаются, то образуются формы со смешанной цитоплазмой и ядрами разного происхождения – гетерокарионы. При размножении полученного в результате гибридизации гетерокариона происходит расщепление – появление в потомстве форм не только с доминантными, но и с рецессивными признаками родителей.
Скрещивание разных линий используют в создании эффективных штаммов дрожжей, для быстрой выпечки хлеба, в пивоварении, в производстве спирта. Мицеллиальные грибы – продуценты антибиотиков и ферментов. Слияние протопластов, трансформация – отмечена ее надежность применения к актиномицетам, бактериям. Протопласт – клетка лишенная кл. стенки. Получение протопласта в лабораторных условиях – протопластирование (у растущих культур), или образование протопластов с внесением ферментов – целлюлоза, гемицеллюлоза, хетиназа, разрушающих кл. стенку. Но ч/з 5-6 мин. кл. стенка возобновляется. Для ускорения процесса слияния протопласт используют- оголение протопласта (оголенная мембрана с «-« зарядом, клетки помещаются в полиэтиленгликоль ПЭГ(индуктор слияния) он меняет проницаемость мембраны; мембр. становится текучей ) После слияния протопластов образуются фузанты (при слиянии более 4 –х клеток). Фузанты становятся нежизнеспособными. Слияние происходит между клетками одного вида или разных видов. Для определения их используют элективные среды.
Цибриды (цитоплазматическая наследственность общая, ядерная наследственность одного вида ) – слияние под действием эл. тока, направленное слияние протопластов 2 –х разных видов ( точечное слияние). Плюсы – 1 выживаемость клеток высокая, эффективное слияние при межродовом слиянии (дрожжи); 2 ускорение нахождения фузантов. Протопласты используются для плазмидной трансформации.
При слиянии протопластов. объединяются целые геномы и все цитоплазматические компоненты родительских клеток (образуются диплоиды, полиплоиды). С помощью слиян. прот. можно получать генетические рекомбинанты тех видов, у которых не обнаружены собственные системы обмена наследственной информацией, и которые в естественных условиях никогда не скрещиваются.
12. Генетическое конструирование микроорганизмов: плазмиды и конъюгация у бактерий.
У бактерий носитель генетической информации – кольцевая хромосома и плазмиды. В клетке содержится их от 10 -200. Плазмиды делятся по способности к репликации :
1 – плазм. меньшего размера ( более 25 МД) с нестрогим контролем репликации(от 1-4 копий на клетку), при конъюгации переносят ген информацию из клетки в клетку( конъюгация – процесс переноса ген –ой инф. то клетки донора в кл. реципиента , осуществляется при контакте клеток м/д собой ).
2 –плазм.( F – фактор ) не имеют особой системы переноса, но содержат особую информацию.
Выделяют 2 этапа переноса:
1 - образование скрещивающихся пар ,для этого необходимо наличие половых ворсинок – пили ( из 12 генов ), формирующихся на поверхности клетки донора;
2 – перенос ДНК плазмида двунитевая ДНК, при переносе через мостик ДНК расплетается и поэтому проходит одна нить ,она замыкается в кольцо и достраивается. Отдающая клетка остается положительной по этому фактору, принимающая так же становится положительной по нему. Мобилизация – перенос неконъюгативных плазмид (F – фактор не может переносится самостоятельно) с помощью коньюгативных ( мобилизуемых ), перенос идет за счет генов коньюгативной плазмиды (белок пилин) Неконьюгат –е плазмиды могут переноситься в составе Ко –интеграта по принципу комплиментарности, при попадании в клетку Ко –интеграты распадаются. Если Ко – интеграт длинный его скорость меньше. При переносе плазмид нужно учитывать совместимость вносимых плазмид с имеющимися. В природных условиях не все плазмиды выживают. Конъюгация применяется при конструировании промышленных штаммов, т. к. можно легко получать генетические рекомбинанты ,производить мобилизацию неконъюгативных плазмид , создавать гибридные плазмиды, объединять различные плазмиды в одной клетке.
13. Генетическое конструирование микроорганизмов: фаги и трансдукция.
Бактериофаги – вирусы бактерий, состоят из ДНК и белка, который образует головку вокруг нуклеиновой кислоты( обычно двуцепочечной , но у РНК содержащих – одноцепочечная). Их воспроизводство идет только в живых клетках. Фаги впрыскивают нуклеиновые кислоты ч/з прокол, в клетке происходит ее многократная репликация ( образуются новые фаги ), далее фаги выходят из клетки путем почкования в окружающую среду, без разрыва всей клетки Плюс фагов в том что с их помощью можно создавать новые штаммы. Функции фагов:
1 – степень взаимодействия фага с участком ДНК;
2 – процесс упаковки ДНК в головку фага;
3 – общая трансдукция – передача фагом различных участков ДНК;
4 – специфическая – перенос определенных участков гена;
5 – неспецифическая - перенос разных участков.
Абортивные трансдуктанты - информация передается не стабильно из поколение в поколение. Трансдуктанты легко отбираются. При упаковке ДНК в головку фага необходимо:
1 – размер пакуемой ДНК должен быть равен головке фага ( плюс в том что фаги могут переносить плазмиды из клетки) , а если размер пакуемой ДНК меньше , то она может быть достроена ( 1 – за счет полимеризации плазмиды ; 2 – за счет ДНК фага редко ). Если размер пакуемой ДНК больше генома фага, то плазмида должна быть укорочена: если она потеряла участки ответственные за репликацию, в дальнейшем она теряет способность к репликации. Трансдукция имеет важное значение для ген –го исследования бактерий, и создания новых штаммов.
Трансформации – перенос фрагмента свободной ДНК. Контакт может быть только с компетентными клетками – способными адсорбировать фрагмент ДНК на клеточной стенке. Способность фрагмента ДНК проникать через клеточную мембрану. В клетке есть мезосомы – пропускают через отдельные участки цитоплазматической мембраны. Можно повысить путем замораживания и размораживания или внесения ионов лития.

14. Генетическое конструирование микроорганизмов: транспозоны.
Транспозируемые элементы – дискретные элементы ДНК, переносимые в приделах репликона (участок способный к воспроизведению) или от одного репликона кт к другому. Истинные транспозоны –Is-элемнеты, включают 200-2000 последовательностей нуклиотидов. Транспозоны Tn – могут переносить целые гены но не большие. Tn 5 – кодирует информацию резистентности к хлоромицину. Так же есть Tn 9 транспозон. Фаг µ транспозон. Фаги включаются в клетку в различные репликоны. Перемещающиеся элементы отличаются по степени специфичности:
1) высоко специфичные - интеграция возможна в один или несколько сайтов;
2) элементы региональной специфичности - интеграция возможна в различные сайты одного района;
3) элементы средней специфичности – интеграция во многие сайты, с меньшим предпочтением одного из них;
4) элементы низкой специфичности – каждый раз перенос происходит в новый сайт.
При увеличении гена на 1000 олигонуклиотидов скорость уменьшается в 2 раза. На перемещение влияет: температура, ультрофиолетовое излучение. Транспозиции:
1) репликативная – слияние донорной и реципиентной ДНК идет с участием фермента транспозазы, далее идет разделение с участием разолвазы.
2) Консервативная – выщепление перемещающейся молекулы донора и внедрение его в молекулу реципиента идет за счет ферментов клетки хозяина.
При перемещении элементов могут возникать - делеции, инверсии, дупликации, транслокации.
Транспозонный мутагенез – метод создания новых промышленных штаммов микроорганизмов. Преимущества перед химическим мутагенезом:
1) при высокой частоте мутаций не происходит гибели организмов;
2) мутации одноступенчатые, сопровождаются утратой функций;
3) в районе репликации обнаруживается делеция;
4) возможно такое выпадение транспозона и постановление функции утраченного гена;
5) возможно добавить свойства без утраты функционирования гена (точная локализация). Транспозоны обеспечивают гомологичную рекомбинацию между не гомологичными участками.
не влияют на репликацию, туда и производят внедрение.
15.Произв-во кормового и пищевого белка . Дефицит кормового белка сдерживает развитие живот-ва. Биологическая ценность белка определяется содержанием в нем незаменимых аминокислот (валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин). Недостаток какой – либо из АК в кормах лимитирует усвояемость остальных, приводит к перерасходу кормов и должен компенсироваться концентрированными кормами. Среди зерновых и зернобобовых культур наиболее сбалансирован по содержанию незаменимых аминокислот белок зерна сои, риса и гороха. В белках зерна пшеницы и ячменя содержится мало лизина, метионина и изолейцина, а в белках зерна кукурузы - триптофана. Одним из путей решения проблемы кормового белка является получение его микробиологическим путем. (дрожжи, бактерии, низкие и высшие грибы и одноклеточные водоросли) М.о. отличаются высоким (до 60% сухой массы) содержанием белка, сбалансированного по АК составу.
Кроме того, м.о. содержат углеводы, липиды, витамины, макро- и микроэлементы. Важным достоинством производства кормового белка на основе м.о. является использование с/х отходов, возможность организации промышленного производства. Кормовые дрожжи получают на отходах деревообрабатывающей, кондитерской, молочной промышленности, сельского хозяйства, парафинов нефти.
Для получения кормовых дрожжей на растительном субстрате (отходы древесины, солома, льняная костра, картофельная мезга, свекловичный жом и др.). наиболее эффективны дрожжи родов (Candida, Torulopsis, Saccharomyces). Растительное сырье, содержащее целлюлозу и гемицеллюлозу, подвергается кислотному гидролизу, в результате чего более половины полисахаридов гидролизуется до моносахаридов.
Кормовые дрожжи выращивают в специальных ферментерах, где обеспечивается перемешивание суспензии микробных клеток в жидкой питательной среде и аэрация. затем культуральная жидкость вместе с клетками дрожжей выводится из ферментера, после чего дрожжи отделяются от жидкости, подвергаются специальной обработке для разрушения клеточных оболочек, упариваются и высушиваются. Субстратом для получения кормовых дрожжей могут служить парафины нефти (и спирты этанол и метанол) в сочетании с макро- и микроэлементами, витаминами и аминокислотами. в СССР годовой объем белково-витаминных концентратов (БВК) полученных из парафинов нефти, достигал 1 млн.т.
Весьма перспективно производство белково-витаминных продуктов при использовании технологических процессов на основе дрожжей, способных к росту на молочной сыворотке. Такой штамм дрожжей T. созданы технологии получения ряда кормовых препаратов на основе микробной переработки молочной сывортоки (Био-Зум, Промикс, .).Препараты ЗЦМ (заменители цельного молока) превосходят сыворотку по содержанию и качеству белка, а также витаминов. Каждая тонна использованного в животноводстве БИО-ЗЦМ высвобождает для пищевых целей 8 т цельного молока.
Производство БОО(белки одноклеточных организмов ) имеет многие преимущества перед производством б-ка в живот-ве и раст-ве: 500 кг дрожжей дают за сутки 80 кг белков, а у быка того же веса суточный привес составляет в лучшем случае 500 г белка. Однако БОО используют в основном как корм для скота, и лишь в будущем можно ожидать создания технологий получения БОО, пригодных для питания человека. Перспективно в этом отношении культивирование некоторых грибов (Fusarium), зеленых водорослей (Chlorella), цианобактерий (Spirulina), имеющих адекватные для человека органолептические свойства. В настоящее время уже налажено производство на базе крахмала волокнистой массы Fusarium как источника пищи для человека.Изменения в генах, осуществленные с помощью генной инженерии, могут модифицировать структуру и улучшать свойства пищевых белков,.

16. Производство АК. Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т в год, В промышленных масштабах белковые АК получают:1) гидролизом природного белоксодержащего сырья; 2) химическим синтезом;3) микробиологическим синтезом;
4) биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).
В ходе кислотного гидролиза б-в происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их АК. При кислотном гидролизе разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10–30%). недостаток методов химического синтеза АК состоит в получении целевых препаратов в виде рацемической смеси D- и L-стереоизомерных форм.
Наиболее перспективен микробиологический синтез АК. Более 60% всех производимых в настоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых АК. получают именно этим способом, преимущество состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.
Способности у м.о. выделять в культуральную среду АК. М.о. – Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата (для производства глутаминовой кислоты).Распространенные объекты селекции рода Brevibacterium, Microcjccus, Corynebacterium, Arthrobacter.
Производство лизина. В клетках м.о. лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего для трех АК – лизина, метионина и треонина.
Эффекта накопления в среде всего одной целевой АК добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных АК, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути. L-лизина – Brevibacterium flavum и C.glutamicum .Чтобы добиться образования лизина в больших количествах, получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезируется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результате чего блокируется синтез метионина и треонина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора – лизина.
Производство триптофана. Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленного метаболического пути, поэтому для его производства используют ауксотрофных мутантов, у которых блокированы реакции, ведущие к синтезу фенилаланина и тирозина. Триптофан оказывает ингибирующее действие на антранилатсинтетазу, поэтому
производство триптофана организовано преимущественно по двухступенчатой схеме. На первом этапе химическим способом синтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системы мутантных штаммов дрожжей Candida utilis переводят в триптофан.
Кроме триптофана микроб-ким способом с использованием предшественников получают гистидин, изолейцин, метионин, серин и треонин. Для получения АК – конечных продуктов неразветвленных метаболических путей, например аргинина, ауксотрофные мутанты не используют. В этом случае применяют мутанты с дефектами регуляции биосинтеза АК, т.е. регуляторные мутанты.

17. Производство витаминов. Витамины представляют собой группу незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимых любому организму В наст вр.создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время вит.. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению вит.: В2, В12, β-каротин (провитамин А) и предшественники вит.D. Остальные вит.либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химически.
Получение вит. В2 (рибофлавин). Вплоть до 30-х г. рибофлавин выделяли из природного сырья. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина – гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами.
Среда культивирования- это соевая мука. Кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, витамины, технический жир. В качестве посевного материала используют споры E. Ashbyii(грибы) выращенные на пшене(8 дней) – это всё в ферментёр, процесс ферментации длиться 3 сут.
В 1983 г. сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризующийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибофлавина. Клонированием генов рибофлавинового оперона в одной из созданных плазмид был получен производственный штамм-продуцент вит. В2, способный синтезировать втрое большее по сравнению с E. ashbyii количество рибофлавина всего за 40 ч ферментации.
Получение витамина В12 (цианокобамид).  из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг вит.. Единственный способ его получения в настоящее время – микробиол-кий синтез. механизмы регуляции биосинтеза витамина В12 до настоящего времени полностью не расшифрованы. Известно, что при высоких концентрациях вит. полностью репрессирует синтез ключевых ферментов своего новообразования.
Продуцентами витамина В12 при его промышленном получении служат актиномицеты, метанобразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. пропионовокислые бактерии, известные ещё с 1906 г. и широко использующиеся при приготовлении препаратов животноводства. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12.Среда культивирования- среда с глю, хлорид кобольта, витамины, неорган.соли, кукурузная мука. В качестве посевного материала используют культуры м.о. выращенных в спец аппаратах – это всё в ферментёр, куртуральную ж-ть упаривают в вакууму, сушат и смешивается с наполнителями.
Получение β-каротина и вит. D2. β-Каротин можно выделить из ряда растительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны. разработана схема микробиологического синтеза β-каротина, которая стала основой промышленного способа его получения. фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи – синтезируют каротин. Характерно, что содержание β-каротина у м.о. во много раз превышает содержание этого провитамина у раст.. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг β-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora – 3–8 тыс. мкг.
Микробиологическим способом получают и вит. D2 (эргокальциферол), при производстве которого освоено дешевое сырье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.
18. Производство органических кислот. уксусная кислота.при производстве используется способность некоторых м.о. окислять этанол. Этот процесс называют уксуснокислым брожением. В качестве сырья используются этанолсодержащие жидкости (вино, забродившие соки), либо же просто водный раствор этилового спирта[11].Штаммы Acetobacter и gluconobacter.
Реакция окисления этанола до уксусной кислоты протекает при участии фермента алкогольоксидазы(алькоголь дегидрогеназы). Это сложный многоступенчатый процесс, который описывается формальным уравнением СН3СН2ОН + О2 → СН3СООН + Н2О, протикает в анаэробных условиях в режимк непрерывного культивирования
Получение лимонной кислоты. Её широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, так как она полностью метаболизируется живыми организмами. Лимонная к-та образует хелаты с металлами, поэтому её применяют для их очистки. Объем мирового производства цитрата составляет 400 тыс. т/год.
Для промышленного производства лим. К-ты используют культуру гриба Aspergillus niger и A. wentii.. Метаболическим источником лимонной кислоты в организме служит цикл трикарбоновых кислот. катализируемая цитратсинтазой, открывает цикл Кребса. Активность фермента зависит от концентрации ЩУК,
Питательные среды для культивирования продуцентов лимонной кислоты в качестве источника углерода содержат дешевое углеводное сырье: мелассу, крахмал и глюкозный сироп. Гриб A. niger чаще всего выращивают на мелассе. Существует несколько технологических вариантов промышленного производства лимонной кислоты. Первоначально был разработан вариант процесса, основывающийся на поверхностной ферментации, позднее — на глубинном культивировании. Последнее ведется в две стадии: на первой стадии идет рост мицелия, а на второй, после выхода культуры в стационарную фазу — интенсивный синтез лимонной кислоты.
Одновременно с лимонной было налажено производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий рода Lactobacillus. Производство D-глюконовой кислоты из глюкозы при участии A.niger. Глюконат натрия, в виде которого обычно выделяют глюконовую кислоту, используют для извлечения металлов, борьбы со ржавчиной, как моющее средство и в качестве медицинского препарата.
Производства, основанные на ацетон-бутанольном брожении и микробиологическая конверсия этанола в ацетат в настоящее время не рентабельны по экономическим соображениям.

19. Биотехнология получения вторичных метаболитов: Получение антибиотиков
Биотехнология получения вторичных метаболитов
Биосинтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит по завершении стадии роста, в идиофазе, благодаря чему их ещё называют идиолитами. Среди вторичных метаболитов ведущее место по объему производства занимают антибиотики.
Антибиотики – самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками. К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Около 97 % известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются.
По типу действия антибиотики делят на бактерицидные, вызывающие гибель микроорганизмов и бактериостатические, нарушающие способность микроорганизмов делиться. По спектру действия различают антибиотики узкого и широкого действия.
Антибиотики широко используются для расшифровки механизмов биосинтеза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок бактерий.
Химические методы получения антибиотиков очень сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получения как природных, так и полусинтетических антибиотиков:
1) ферментация микроорганизма-продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез антибиотиков в идиофазе;
2) использование для биосинтеза блокированных мутантов. У таких мутантов блокирован синтез нужного антибиотика. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников антибиотика, их переводят в аналоги самого антибиотика. Этот процесс называется биосинтез, или мутасинтез:
а) предполагается последовательность реакций, ведущая к синтезу антибиотика
б) отсутствие синтеза антибиотика у «блокированного» мутанта
блокированное звено метаболизма
в) синтез модифицированного антибиотика после введения аналога предшественника – модифицированный антибиотик.
Антибиотики продуцируются плесневыми грибами, актинамицетами, эубактериями и другими микроорганизмами. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces.
Процесс культивирования идиолитов проходит две фазы (двухступенчатое культивирование). На первой фазе происходит накопление достаточного количества биомассы, которая выращивается на подходящей для роста микроорганизма среде. Эта фаза должна быть быстрой, а питательная среда дешёвой. На второй фазе осуществляется запуск и активный синтез антибиотика. На этой фазе ферментацию ведут на продуктивной среде. Образование антибиотиков регулируется условиями культивирования микроорганизмов. Поэтому оптимизация питательной среды является главным фактором в повышении выхода продукта

20.СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ. Спиртовым брожением называется процесс расщепления сахара микроорганизмами с образованием этилового спирта и углекислого газа. С6Н12О6 - 2СН3СН2ОН+2СО2
Возбудителями спиртового брожения являются дрожи сахаромицеты, некоторые мицеальные грибы. Даже растения и грибы в анаэробных условиях способны накапливать этиловый спирт.Процесс проходит 2 стадии.
1. Окислительная - превращение глюкозы до пировиноградной кислоты (пируват) и отнятие двух пар водорода. С6Н12О6--2СН3СОСООН= “НАД (кофермент) Н2О
2. Далее пируват декарбоксилируется пируваткарбоксилазой при участии тиаминпирофрсфата до ацетальдегида, а затем ацетальдегид восстанавливается алкогольдегидрогеназой в этанол при участии кофермента НАД.
Условия спиртового брожения На развитие дрожжей и ход брожения влияют: химический состав сбраживаемой среды, концентрация и кис-ть среды, содержание спирта, темпер, наличие посторонних м.о. Большинство дрожжей способны сбраживать моносахариды, а из дисахаридов-сахарозу и мальтозу. Дрожжи не могут сбраживать крахмал, так как они не образуют амилолитических ферментов.
Наиболее благоприятная конц.сахара- от 10 до 15%. При повышении концентрации сахара энергия брожения снижается, а при 30-35% сахара брожение прекращается. Норм. брожение протекает в кислой среде, при рН 4-5. В щелочной среде в результате брожения образуется глицерин. При темпер. 45-50оС брожение прекращается в результате гибели клеток дрожжей.
Технология производства пива включает следующие основные этапы:
1.Подработка солода — проращивание зёрен злаков. Замачивание приостанавливают при достижении влажности зерна 42— 45% при производстве сушка и очистка от ростков.
2.Затирание — солод размельчается и смешивается  с горячей водой в соотношении 1:4.Смесь при этом приобретает сладковатый вкус.
3.Фильтрация затора — затор перекачивается в фильтр — чан, где происходит его разделение на неохмелённое сусло и дробину.
4.Кипячение сусла — сусло с добавлением хмеля, а также других ингредиентов, варится 1-2 часа.
5.Осветление сусла — сусло перекачивают в вихревую ванну для отделения нерастворимых остатков ячменя и хмеля.
6.Охлаждение и аэрация сусла — сусло перекачивается в бродильный резервуар.
7.Брожение — простейшие сахара, содержащиеся в сусле, при помощи дрожжей превращаются в спирт и углекислый газ.
8.Выдержка (дображивание) пива способствует окончательному формированию потребительских достоинств пива. Для дображивания молодое пиво перекачивают в герметично закрывающиеся металлические танки, внутренняя поверхность которых покрыта специальным пищевым лаком.
9.Фильтрация — пиво фильтруется от остатков дрожжей.10.Пастеризация — некоторые сорта пива подвергаются пастеризации — нагреванию до температуры порядка 68-72 °C, для увеличения срока хранения.

21. Основные стадии производства виногр. вин: 1)–– получение виноградного сусла;2)— брожение сусла;3)— обработка и выдержка вин.
Существует две основные технологические схемы переработки винограда на сусло:
1) по белому способу — с быстрым отделением сусла от мезги и последующим сбраживанием сусла;
2) по красному — с брожением мезги;
3) допускаются различные виды экстрагирования мезги.
По белому способу перерабатывают виноград как белых, так и окрашенных сортов целыми гроздьями или с предварительным дроблением ягод. Технология переработки винограда по бел. способу предусматривает ряд приемов, которые исключают переход в сусло экстрактивных и красящих веществ кожицы, ухудшающей качество белых вин. По этому способу получают белые натуральные вина, шампанские, коньячные и хересные виноматериалы.
Виноград перерабатывают в течение 4 часов после его сбора, не позднее. Виноград дробят на дробилках, в результате получают мезгу: смесь кожицы, семян, мякоти и сока (суспензия). От мезги самопроизвольно отделяется сусло — самотек — самая ценная фракция, из которой получают высококачественные вина. Для выделения оставшегося сусла мезгу прессуют на механических прессах. Получают сусло I, II, III фракции давления. Сусло I давления полностью или частично идет на производство марочных вин, сусло II и III давления — на получение всех остальных типов вин. Полученное сусло осветляют путем отстаивания с целью удаления взвешенных частиц. В процессе отстаивания сусло обрабатывают диоксидом серы или сернистой кислотой для предотвращения окислительных процессов и развития посторонних микроорганизмов. Осветленное сусло направляют на брожение. Сбраживание осуществляется чистой культурой винных дрожжей при температуре 14—18°С, но не выше 22°С. В результате получают молодое вино.
По красному способу готовят красные натуральные вина (портвейн, мадера, марсала), все наименования десертных вин, некоторые марки розовых и желтых вин. Полученное по белому и по красному способу молодое вино направляется на выдержу. В процессе выдержки формируются вкус и букет, характерный для вина данного типа, выпадают в осадок нестойкие соединения и микроорганизмы. Вино осветляется, т. е. «снимается с дрожжей». Для выдержки или созревания используют деревянные бочки, крупные металлические резервуары (с аэрацией для удаления углекислого газа, растворенного в вине), бутылки.
При выдержке в деревянных бочках происходит газообмен между вином и воздухом, а также экстракция вином из древесины фенольных и ароматических веществ. Это способствует созреванию молодых виноматериалов. Выдержка в крупных резервуарах протекает без доступа кислорода воздуха.
В процессе выдержки проводят переливку и доливку. Цель переливки — отделение осветленного виноматериала и насыщение его кислородом воздуха. Доливка необходима для того, чтобы исключить образования над вином свободного воздушного пространства. Доливку проводят при выдержке в деревянной таре, где происходит уменьшение объема вина за счет испарения через поры древесины. Крепкие вина доливают 1—2 раза в год, десертные— 1 раз в месяц, натуральные — не реже 1 раза в неделю. Переливку осуществляют до 4 раз в год в зависимости от типа вина — в процессе созревания вина в емкостях оно приобретает прозрачность, более тонкий вкус и букет (аромат).
В бутылках проводят выдержку коллекционных вин, где происходит старение без доступа воздуха. При этом улучшается вкус и образуется особый букет вина. Стареет вино в энотеке. Для придания винам стабильности и прозрачности их подвергают различным видам обработки: физическим, физико-химическим, химическим, биохимическим. К физическим способам относятся центрифугирование, фильтрация, термическая обработка.

22. Б/т бродильных производств. Пропионово-кислое брожение: производство сыра.
Пропионовокислое брожение представляет собой процесс превращения сахара или молочной кислоты в пропионовую и уксусную кислоты с образованием углекислоты и воды: Брожение вызывается пропионовокислыми бактериями. Это короткие, неподвижные, бесспоровые анаэробные палочки, оптимальная температура развития которых около 30°С.
Пропионово-кислые бактерии близки к молочнокислым бактериям и нередко развиваются вместе с ними. Следует отметить, что пропионовокислому брожению могут подвергаться не только молочная кислота, но и ее соли. Это брожение имеет важное значение в созревании сыров. Молочная кислота (вернее, ее кальциевая соль), образующаяся в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий, под влиянием пропионовокислых бактерий превращается в пропионовую кислоту, уксусную кислоту и углекислый газ. Выделение углекислоты приводит к образованию глазков в сыре, придающих ему характерный ноздреватый рисунок. Пропионовая и уксусная кислоты способствуют образованию специфического сырного вкуса и запаха.
На крупных предприятиях производство сыра включает следующие стадии:
1.подготовка молока; 2.процесс свертывания;   3. формование, прессование;
4.посолка;   5.образование сырного зерна;
6.созревание и хранение.
В специальных  лабораториях молоко взвешивается, производится оценка качества, выполняется очистка, охлаждение и сепарирование. В ваннах для сыроделания или сыроизготовителях, молоко нагревается до температуры необходимой для его свертывания, добавляются специальные добавки: бактериальные закваски, сычужный фермент, хлористый кальций, другие компоненты. Затем выполняют вымешивание массы и формование сыра из пласта. На крупных предприятиях  для этого применяют горизонтальные или вертикальные формовочных аппарат, а. на небольших перфорированные ковши. Далее производители сыра при помощи вертикальных, карусельных, туннельных или горизонтальных прессов использованием вертикальных, карусельных, горизонтальных, туннельных и других прессов придают сыру определённую форму, после чего питательный продукт отправляется для посолки в сольные бассейны, заполненные рассолом. Завершается сыроварение созреванием и хранением в специальных камерах, с оптимальным режимом температуры и влажности. В этих камерах сырные головки, предварительно обёрнутые специальной пленкой, помещаются на контейнеры, стеллажи или полки. На стадии созревания сыр регулярно моют и сушат. Промышленное производство сыра возможно как вручную так и с применением автоматизированных линий. Чем выше уровень технологической оснащенности предприятия, тем более качественным, полезным и питательным получается конечный продукт.

23. Биотехнология бродильных производств. Ацетонобутиловое брожение: производство бутилового спирта и ацетона.
Близким к маслянокислому брожению является ацетонобутиловое брожение, в процессе которого образуется больше количество бутилового спирта и ацетона, чем при обычном маслянокислом брожении. При этом образуются этиловый спирт, масляная и уксусная кислота, выделяются водород и углекислый газ.
Ацетонобутиловое брожение протекает в две фазы:
1 кислотная, во время которой усиленно размножаются бактерии и в среде накапливается масляная и уксусная кислоты.
2. ацетонобутиловая, в течение которой кислотность уменьшается и происходит усиленное накопление ацетона, бутилового и этилового спиртов.
К числу органических растворителей относятся ацетон и бутиловый спирт. Их можно получить не только химическим путем, но и с помощью микробиологического синтеза. Брожение ацетона и бутилового спирта является анаэробным процессом, вызывается бактериями Clostridium acetobutilicum или близкими к ним видами маслянокислых бактерий. Ацетон и бутиловый спирт получают, сбраживая зерновые, мелассно-зерновые заторы или мелассу. Если среду готовят из зерна, например, кукурузы, то сначала получают муку грубого помола, ее смешивают с водой из расчета 6—8 кг муки на 100 л воды. Затем затор варят 2 ч под давлением 0,2 МПа и стерилизуют. Охлажденную до 37—42°С массу сбраживают в течение 2 сут, рН среды 5—7. В процессе брожения из глюкозы образуется смесь, содержащая 6 частей бутилового спирта, 1 часть этилового спирта и 3 части ацетона .Практически из 3 кг крахмала получается 1 кг органических растворителей. Разработаны методы получения ацетона и бутилового спирта из сульфитного щ«лока и гидролизатов древесины.
В ацетоно-бутиловом брожении в первый период образуется уксусная и масляная кислоты, выделяется водород и углекислый газ. Затем масляная кислота восстанавливается до бутилового спирта. Ацетон образуется из продукта конденсации уксусной кислоты — ацетонуксусной кислоты при декарбоксилировании. Во время брожения в среде накапливается много рибофлавина, причем количество его тем больше, чем интенсивнее образуется ацетон. Разработаны способы получения кормового препарата рибофлавина из ацетоно-бутиловой барды после отделения органических растворителей.

24. Иммобилизованные ферменты, их преимущества перед чистыми ферментами. Применение иммобилизованных ферментов.
Иммобилизованными ферментами называются ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства.
Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью. Для иммобилизации ферментов используются также различные типы
неорганических носителей, таких, как создаваемые на основе силикагеля, глины, керамик, природных минералов, металлов и их оксидов. Более пригодными для промышленного использования могут оказаться природные алюмосиликаты – глины, а также пористая керамика. Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема.
В медицинских целях и некоторых фундаментальных исследованиях достаточно широко используется метод иммобилизации ферментов путем их включения в липосомы, поскольку такие системы близки природным мембранам и могут дать весьма ценную информацию о ферментативных процессах, протекающих в клетках.
Иммобилизованные ферменты имеют огромное значение для медицины. В частности, большой рынок сбыта занимают тромбо- литические ферменты, предназначенные для борьбы с сердечнососудистыми заболеваниями. Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокислоты (например, аспарагиназа), используют для борьбы со злокачественным ростом опухолей.
Иммобилизованные ферменты могут использоваться и как усилители слабых сигналов. На активный центр иммобилизованного фермента можно подействовать через носитель, подвергая последний ультразвуковой обработке, механическим нагрузкам или фотохимическим превращениям. Это позволяет регулировать каталитическую активность системы фермент - носитель под действием механических, ультразвуковых и световых сигналов. На этой основе были созданы механо- и звуко чувствительные датчики и открыт путь к бес серебряной фотографии.
Промышленные процессы с применением иммобилизованных ферментов внедрены прежде всего в пищевую и фармацевтическую промышленность. В пищевой промышленности с участием иммобилизованных ферментов идут процессы получения глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, яблочной и аспарагиновой кислоты, оптически активных L- аминокислот, диетического безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки и др.

25. Физические методы иммобилизации ферментов.
Иммобил-я фермента-его включение в как-либо изолир.фазу,кот.отделена от фазы свободн.рас-ра,но спос. обменив-ся с находящ. в фазе мол.субстрата или эффектора.4мет
Преимущество этого метода в том, что активный центр сохраняет свою способность.
Первый физический метод был получен в конце 60 гг. Используется твердая фаза, водный раствор. В качестве твердых носителей: органические и неорганические носители.
Носители разделяются на:
органические неорганические
низкомолекулярные макроэлементы
полимерные
Неорганические: кремнезем, оксид аммония, алюмосиликаты (глина, пористое стекло, керамика, активный уголь) в виде шариков или порошков.Органические: полисахариды, полимерные ионные смеси – шарики, порошки, гранулы.
Требования к носителю: - высокая химическая и биологическая стойкость; - высокая прочность; - достаточная проницаемость для фермента и субстрата; - удобство для экспериментатора; - высокая гидрофильность; - невысокая стоимость.
Ферменты удерживаются: водородными, вандервальсовыми, электростатическими связями.
2 метод иммобилизации ферментов путем внесения в гель. Использую фермент и полимерную сетку геля. Существует несколько способов иммобилизации в гель:
1фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию.
2 фермент включают в раствор готового полимера, который затем переводят в гелеобразное состояние.
На каталитическую активность фермента влияет: количество фермента; диаметр пор; скорость диффузии субстрата в гель (она должна быть оптимальна).
3. метод с помощью полунепроницаемой оболочки мембраны. Способы:
Микрокапсулирование – водный раствор дегидрируют при перемещение в диэфирном эфире, затем добавляют диэфирный раствор полимера, который не может растворяться в воде и образует микрокапсулы. Включения в волокна: для этого эмульсию в водный раствор в органический растворители, волокно образующего полимера проталкивают через фильтр в жидкость вызывающую коагуляцию. Получение липосом; раствор липида в органическом растворители наслаивают на воду, а затем этот растворитель удаляют путем испарения, на поверхности раствора – липидная пленка путем встряхивания капли.
Четвертый метод с использованием систем второго типа. Здесь субстрат и продукты отделены. Субстрат может быть высокомолекулярным соединением. Недостатком является то, что небольшая часть ферментов поступает в фазу где продукты находятся и следовательно нужно очистка продуктов и частичная потеря катализатора.
26 Химические методы иммобилизации ферментов
Иммобил-я фермента-его включение в как-либо изолир. фазу,кот.отделена от фазы свободн.рас-ра,но спос. обменив-ся с находящ. в фазе мол.субстрата или эффектора .Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Достоинства этого метода: высокая стабильность; прочное связывание; работа фермента не зависит от внешних воздействий.
Ковалентное связывание – создание конструкций из связанных химическими связями 3 элементов: Н-С-Ф или двух элементов: Н-Ф, С-Ф.
Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами.
1), ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции.
2), химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При хим. модификации фермента его активный центр желательно защищать. Сложные и дорогие поэтому в промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации
Приемы хим.(ковалентн.)им.ферм.1.Р-ии образ-я амидн.связи-примен.р-ия ацилир-я амидн.группы.2.Р-ии образ-я карбамид.связ. (производных мочевины).3 Р-ии образ.вторич.аминов.-р-ии алкилиров-я и арилиров-я,восстановление азометонов.связей.4.Р-ии азосочетания(образ-е азосоединен.) 5.Р-ии тиол-дисульфид. обмена(образ.дисульфюсвязи) 6.Радикальн. р-ии(граф-сопоме- ризация)

27. Биотехнология получения биогаза. Биогаз — газ, получаемый водородным или метановым брожением биомассы под воздействием трёх видов бактерий. В цепочке питания последующие бактерии питаются продуктами жизнедеятельности предыдущих. Первый вид — бактерии гидролизные, второй — кислотообразующие, третий — метанообразующие.
Состав биогаза-50—87 % метана, 13—50 % CO2, незначительные примеси H2 и H2S. После очистки биогаза от СО2 получается биометан. Биометан — полный аналог природного газа, отличие только в происхождении.
Сырьем м.б развичные продукты(навоз, птичий помёт, пивная дробина, свекольный жом, фекальные осадки, отходы рыбного и забойного цеха кровь, жир, кишки, каныга, трава, бытовые отходы, отходы молокозаводов
Выход биогаза зависит от содержания сухого вещества и вида используемого сырья. Из тонны навоза биогаз с содержанием метана 60 %, из растений с 70 % метана. Максимальное количество биогаза с содержанием метана 87 % — можно получить из жира.
Процесс производства биогаза м.б. разделен на 3 стадии: гидролиз, окисление и образование метана.
1-й этап, (гидролиз), органическое вещество ферментируется внешне внеклеточными ферментами (клетчатка, амилаза, протеаза и липаза) микроорганизмов. Бактерии разлагают длинные цепочки сложных углеводородов, протеины и липиды - в более короткие цепочки.
2-й этап – Сбраживание.Кислотопродуцирующие бактерии, которые принимают участие во втором этапе образования биогаза, расщепляют сложные органические соединения (клетчатку, белки, жиры и др.) в более простые. в сбраживаемой среде появляются первичные продукты брожения —летучие жирные кислоты, низшие спирты, водород, окись углерода, уксусная и муравьиная кислоты и др. эти вещества являются источником питания для метанобразующих бактерий, которые превращают органические кислоты в биогаз.
Третий этап - Образование метана.Метанопроизводящие бактерии, вовлеченные на третьем этапе, разлагают образования с низким молекулярным весом. Они утилизируют водород, углекислоту и уксусную кислоту. Метанообразующие бактерии очень чувствительны к изменениям окружающей среды, поэтому от условий, которые создаются для жизнедеятельности метанобразующих бактерий, зависит интенсивность газовыделения.
Принцип работы установки. Биомасса периодически подаются с помощью насосной станции или загрузчика в реактор. Реактор представляет собой подогреваемый и утепленный резервуар, оборудованный миксерами. В реакторе живут полезные бактерии, питающиеся биомассой. Продуктом жизнедеятельности бактерий является биогаз. Для поддержания жизни бактерий требуется подача корма, подогрев до 35-38 °С и периодическое перемешивание. Образующийся биогаз скапливается в хранилище (газгольдере), затем проходит систему очистки и подается к потребителям (котел или электрогенератор). Реактор работает без доступа воздуха, герметичен и неопасен.
Применение Биогаза. используют в качестве топлива для производства: электроэнергии, тепла или пара, или в качестве автомобильного топлива.

28. Биотехнология производства бактериальных энтомопатогенных препаратов
Среди всех выпускаемых микробных патогенов бактериальные препараты получили наибольшее распространение. Их отличают достаточно высокая вирулентность по отношению к насекомому-вредителю, безопасность для флоры и фауны, высокая скорость воздействия на вредителя. Биотехнологическое производство представляет собой глубинное культивирование с целью получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсинов. При промышленном производстве энтомопатогенных штаммов, как Bacillus. thuriniensis приходиться сталкиваться с таким рядом трудностей, как фаголизис производственной культуры. Поэтому на производствах, кроме общепринятых приемов, стараются использовать фагоустойчивые варианты штаммов и проводить их регулярную смену, вплоть до изменения в номенклатуре выпускаемых энтомопатогенных препаратов.
Технология производства включает все стадии характерные для любого микробиологического производства:
-выращивание посевного препарата в лаборатории и посевном аппарате,
-промышленное культивирование в ферментере,
-концентрирование культуральной жидкости, сушка, стандартизация, фасовка готового препарата.
В условиях предприятия производственный штамм Bacillus. thuriniensis высеивают на мясопептонный агар и проверяют на отсутствие свободного фага. Посевной материал выращивают в несколько стадий. Сначала выращивают на конических колбах 3 л, засевают посевной аппарат и проводят культивирование, в затем передают на ферментер. Температура при культивирование поддерживается постоянной (28-30). Продолжительность ферментации в посевном аппарате составляет 35-40 часов. Если посевной материал в виде спор, то используют одну питательную среду на всех стадиях. Как правила это дрожжи-полисахаридная среда. Если не предполагается довести до стадии спор, более концентрированная среда. Процесс заканчивается при споруляции культуры не менее 90-95% и в титре содержание спор 109 на 1 мл. Подщелачивают до 6-6.5 рН и передают на стадию сепарации. В результате сепарации получают пасту 85% влажности с выходом 100 кг в 1 м3 культуральной жидкости. Ее собирают в отдельном сборнике, а фугат при необходимости можно еще раз употребить. Собранную посту помешивают в течение 30 мин, и отбирают различные пробы. Конечный продукт либо смачивающий порошок, либо паста. Затем происходит фасовка препарата.

29. Биотехнология производства грибных энтомопатогенных препаратов.
Энтомопатогенные препараты на основе грибов способны поражать большое кол-во вредных насекомых, вызывая у них – микоз. Грибы обладают рядом особенностей:
а) поражение происходит ч/з кутикулу, а не ч/з пищ-й тракт;
б) насекомые поражаются в фазе развития куколки и иманго,
в) у грибов большая скорость роста и огромная репродуктивная способность, длительное время могут находиться в виде спор,
г) высокая специфичность в поражении отдельных видов насекомых.
Воздействие грибного препарата начинается с проникновения споры в полость тела насекомого, затем спора прорастает в гифу, а затем в мицелий, от него отчленяются конидии, составляющие инфекционную единицу энтомопатагенных грибов. При благоприятных условиях конидии образуются на поверхности кутикулы. Конидии своими апрессориями прикреп-я к кутикуле и пускают мицелл-е отростки в тело. Оказавшись в теле конидии циркулируют по гемолимфе и начинают развитие гриба. Некоторые грибы выделяют много токсинов. Летальный исход наблюдается из-за наруш-й циркуляции гемолимфы и от выделения грибом токс-х в-в.
Период прорастания конидий и до гибели насекомого от 2 до 8 сут.
Производство препаратов основывается на следующих родах: Beauweria, Metarrhizium и Enthomophthora. Хорошо освоено получение препарата на основе боверина. Готовый препарат выпускается в виде порошка белого или кремового цвета. Препарат безвреден для теплокровных животных и чаще не выз-ет ожогов у растений. Боверин получают с помощью глубинного или поверхностного культивирования. Глубинное культ-е более экон. При глуб-м культивировании гриб размножается вегетативно, образуя гифальные тельца - гонидии.

30. Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают наибольшей специфичностью по отношению к насекомому-хозяину. Они поражают не более одного вида. Их ярко выраженная специфичность обуславливает практическую безвредность вирусных препаратов для человека, флоры и фауны.
Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, они способны сохранять активность в течение 10-15 лет, находясь вне насекомого. Заражение вирусом происходит при питании вредителя. Попавшие в кишечник тельца-включения при щелочных значениях рН разрушаются. Освобожденные вирионы проникают через стенку кишечника в клетки, где в ядрах происходит репликация вирусов. Высвободившиеся вирусы заражают другие клетки, что в итоге приводит к гибели насекомого. Отличительной особенностью вирусов является то, что они могут размножаться только в живой ткани. Это создает определенные трудности в организации промышленного производства, так как технология размножения вирусов должна быть связана с использованием живых насекомых-хозяев.
В нашей стране осуществляется выпуск трех вирусных энтомопатогенных препаратов: вирин-ЭКС (против капустной совки), ЭНШ (против непарного шелкопряда) и АББ (против американской белой бабочки).
Производство любого из вирусных препаратов начинают с разведения насекомого-хозяина на искусственных питательных средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной стадии развития ( обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предварительно получают от нескольких больных личинок. После заражения насекомых выдерживают в строго определенных условиях, обеспечивающих максимальное накопление вируса в тканях. Через 7-9 суток собирают мертвые и отмирающие личинки, подсушивают при температуре 33-35оС, измельчают механическим способом для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь полученных тканей фильтруют.
При производстве вирин-ЭКС полиэдры осаждают из фильтрата центрифугированием. Осадок суспендируют в минимальном количестве дистиллированной воды и добавляют простерилизованный глицерин до титра 1 млрд. полиэдров в 1 мл. Готовый препарат разливают во флаконы. При производстве вирин-ЭНШ в фильтрат добавляют лактозу, а после перемешивания ацетон в соотношении 4:1 к объему суспензии. После отстаивания надосадочную жидкость сливают, осадок подсушивают до полного удаления ацетона. Если препарат планируется выпускать в виде порошка, то сухой осадок смешивают с мелкодисперсным наполнителем (каолином, например) до получения титра полиэдров 1 млрд. полиэдров в 1 грамме.
Масляную форму препарата получают путем диспергирования осадка в стерильном 50% растворе глицерина до титра 2 млрд. полиэдров в 1 мл, а затем добавляют равный объем солярового масла, перемешивают и разливают по флаконам. Вирусные энтомопатогенные препараты применяют путем внесения полиэдров в плотные популяции насекомых-вредителей с целью возникновения в них эпизоотий. Данный способ обработки предполагает внесение небольших количеств препарата. В другом случае опрыскивание или опыление производят на зараженных участках в период рождения личинок или на ранних стадиях их развития.

31. Технология производства бактериальных удобрений
С целью стимулирования деят-ти почв микрофлоры применяют бакт.удобрения, которые обогащают ризосферу растения полезными микроорганизмами.
Нитрагин: бакт удобрение, приготовленное на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из р. Rhizobium, предназначен для почв урожая бобовых растений. Бактерии в симбиозе с боб раст способны фиксировать свобод азот, превращая его в соединение легкоусвояемые раст. Бактерии – строгие аэробы. Среди них выделяют:
- активные; - малоактивные; - неактивные.
Фиксация азота возможна только в образующихся в корневой системе раст клубеньках .Заражения корн с-мы происх только через молод корн волоски; . месте локализации бактерий на корне обр-ся клубеньки. Если они красноватые или розоватые, в них пигмент-легоглобин, то эти бактерии способны фиксировать молекулярный азот .
Бактерии синтезируют ферментативную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливают молекулярный азот до аммиака. Налажено произ-во 2х видов нитрагина: почвенного и сухого. Почвен представ собой культуру клубеньковых бактерий ,выращ в стерильной почве. Технология его произ-ва имеет ограниченное значение в виду сложности и трудоемкости.Сухой- порошок светло-серого или коричневого цвета.
Промыш произ-во нитрагина построено по схеме: для произ-ва посевного материала исходную культуру клубеньков бактер выращ сначала на агаризованной среде, затем полученную культуру размножают в колбах на жидкой питательной среде в теч-е 1-2 сут. Готовую культуру перед в посев аппарат и продолж выращ в усл-ях постоян перемешивания и принудительной аэрации. К концу процесса культивирования штамм нах-ся в стадии опаясанных палочек. Готовую культур жидкость направл на сепарацию, в результате кот отделяется биомасса в виде пасты влажностью 70-80 %.Пасту смешивают с защит средой и напр на высуш-е. Процесс сушки осущ в вакуум-сушильных шкафах. Высушенную биомассу размалывают в штамм.
Препараты нитрагина прим на фоне фосфорно-калиевых и органических удобрений, кот повыш актиность клуб бактерий. Нитрагин способств увел урожайности бобо раст на 15-25%. Вносят препараты путем опудривания семян сухим нитрагином перед посевом.
Азотобактерин почвенный и торфяной. Эти виды представляют собой актив культуру азотобактерина, размытой на тв. питательной среде. Для их приготовления берут плодородную почву или разлагающийся торф с нейтрал реак-й среды+ до 2% извести и 0,1% суперфосфата. увлажняют на 40-60% и стерилизуют. Посев материал готовят на агаровых средах., Культивирование продолжается пока в 1г почвы не будет 50 млн бактерий. Использование препарата азотобактерина рекомендовано лишь в плодород почвах, содер фосфор и микроэл-ты. Способ применения сухого азотобактер зависит от особ-ей посев материала. Семена зерновых опудривают сухим препаратом.. Фосфобактерин.содержит споры Bacillus megaterius.Её выращивают глубин.способом.Пит.среды-кукуруз. экстракт, меласса.Культив-е проводят в асептич.условиях,пост.перемеш. и аэрация.Получен.в ходе культив-я биомассу кл. отделяют центрифугир-ем, высушывают в распыл.сушилке.в 1гр.-8млрд. кл. Он увелич.урожай зерновых,картофеля,сахарн.свеклы.
32. Истории биотехнологии растений 1839 г., Т. Schwann и М. Schleiden выдвинули теорию тотипотентности. Родоначальником экспериментов в  б/т раст. был немецкий физиолог G. Haberlandt. Ему принадлежит заслуга разработки теорет. основ методов асептического выращивания изолированных органов и тканей раст. в искусственных условиях. В 1922 г. появились первые публикации L. Knudson, в которых он описывал разработанную им методику асимбиотического проращивания семян орхидных. В начале XX в. G. Robbins и S. Kotte независимо друг от друга положили начало культивированию in vitro кончиков корней орхидных и почек различных растений .
1934 г. М. White опубликовал результаты успешного изучения культивирования in vitro растительных тканей и целых органов. Ему первому удалось сохранить жизнедеятельность и спровоцировать рост корней томатов, используя в качестве основных компонентов питательной среды глюкозу и дрожжевую вытяжку.
Бурное развитие исследований в области культуры тканей растений началось после того, как С. Went и F. Thimann в 1935-1937 гг. обнаружили в растительных тканях ауксин – ИУК. Открытие влияния ауксинов на рост и деление клеток сделало возможным исследование условий, необходимых для роста и развития клеток тканей и органов растений in vitro.
Первые опыты по культивированию in vitro зародышей цветковых растений провел К. Hanning в 1902 г. перед исследователями открылись предпосылки практического применения культур in vitro. F. Limasset и L. Comuet (1956), которые работали над размножением растений из конусов нарастания в асептической культуре, отметили, что используя этот метод, можно получить оздоровленные растения.
В 1954 г. W. Muir и его группа впервые получили в культуре in vitro целое растение из одной клетки. В 1960-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза, возглавляемой Р.Г. Бутенко, начаты работы по оздоровлению меристем растений и последующему их клональному размножению. В данном аспекте были изучены условия микроразмножения целого ряда ценных с/х и промышленных культур. 1951-1957. С использованием изолированных протопластов и генетических векторов на основе Ti-плазмид и баллистического введения генов в клетки и ткани реципиентов стало возможным получение трансгенных растений. На сегодняшний день получены трансгенные растения кукурузы, сои, пшеницы, картофеля, томатов и других с/х культур .
Л.A. Луговоя (2003) Метод флуид-дрилинга . Этот метод способствует быстрому и равномерному развитию всех растений, что в конечном счете приводит к более ранней уборке урожая. Последние 20-30 лет идет интенсивное накопление информации об особенностях культивирования различных видов мировой флоры в асептических условиях.
Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на 2 группы.
1: оплодотворение in vitro ), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей ,получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, , клональное микроразмножение отдаленных гибридов.
2 методов : клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов),
применение методов генной инженерии. Оплодотворение in vitro можно осуществить 2 способами: а) культивирование на искусственной агаризованной пит. среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. прошло ли оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу.
33 Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы.
Для удобства проведения дезинфекции полы и стены в помещениях должны иметь кафельное покрытие, а потолок должен быть побелен. Оборудование моечной комнаты: мойки с горячей и холодной водой; дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды – до 100–130оС, для инструментов – до 170оС; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H2SO4 98 % + K2CrO7).
Оборудование комнаты для приготовления питательных сред: лабораторные столы; холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и витаминов; аналитические и торсионные весы; иономер; магнитные мешалки; плитки, газовые горелки; набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы – давление 1–2 атмосферы и температура 120оС; стеллажи для штативов с питательными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.
Оборудование комнаты для инокуляции растительных эксплантов на питательные среды: ламинар-боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные лампы, шкафы для материалов и оборудования. Помещение, где ведутся работы с культурами тканей необходимо периодически стерилизовать ультрафиолетовыми лампами (кварцевать).
Оборудование культуральных комнат: световое отделение – источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25+ – 2оС) и влажности воздуха (70 %), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение – с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха.
Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.
34.Состав пит . среды. Основу пит . ср. составляют источники С, мин. эл, и ростовыйфакторы.
Источники С- простые и сложные в-ва(белки, пептиды, целлюлоза; метан, метанол, угольная к-та)
Мин. эл. -макро- и микроэлементы (N, P, K, Ca, S, Mg, Fe, B, Zn, Cu, Co, Mn, J, Mo).Ростовые фак-ры- Витамины, ам.к-ты, гормоны (ауксины, цитокинины) гиберелины. Кроме этогочасто используют ростовые добавки-картофельный сок, экстракт кукурузы, проростков ячменя, кокосовое молоко.
На средах без гормонов растут “привыкшие” и опухолевые ткани. Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов. Из ауксинов чаще всего применяют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) - 0.1-10 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0.1-2 мг/л, ИУК - 1-30 мг/л. Для индукции каллусогенеза используют более высокие концентрации ауксинов, в дальнейшем ткань может расти при более низком содержании ауксинов.
В качестве цитокининов используют кинетин, 6-бензиламинопурин (БАП), зеатин (0.001-10 мг/л); из них кинетин наименее активен. В состав некоторых сред входит аденин. Иногда используют гибберелловую кислоту (ГК). В качестве ростактиваторов применяют также кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др.
Все компоненты пит.сред подбираются по индивидуальным особенностям. Транспорт в-в осуществляется насосами или транспортерами, сыпучие компоненты – вакуумными насосами. Часть компонентов(соли) предварительно растворяют.
Состав питательных сред для культивирования биотехнологических объектов зависит от типа их питания:
-среда без глюкозы - для хлореллы, цианобактерий;
- среда без витаминов и гормонов - для грибов (фузариума, ботритиса) и для ряски (Lemna);
- среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами - для культивирования клеток и тканей высших растений.
Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др.
Важным принципом приготовления пит.среды является соблюдение асептики (поддержание опред.значения ph,т.к.это препятствует развитию посторонниз микро орг-мов). Используют разные способы стерелизации(стерелизуют входящий и выходящий воздух и сами ферм-ты). Воздух и газы стерелизуют с помощью сист-мы мембр.фильтров.
Пит.среды м.б. простерелизованы различными методами:
Термический-самый распространенный(недостаток – требует много времени и потеря пит в-в среды, т.к. большинство углеводов термически не стабильны.)
Радиационный-оч.эффективный, не теряются пит св-ва, но весьма дорогостоящий.
Химический- использование хим.препоратов. требование к ним- их полное разложение после воздействия,т.к. еготудно вывесты послеизбиореактора.
Метод фильтрации- может использоваться для жидкихсред, основан на использовании полупроницаемых мембран(пропускают жидкую среду, и концентрируют на своей пов-ти микро орг-мы)
35 СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ. Стерилизация растительных эксплантатов.
Объяснение. Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов.Чаще всего для стерилизации помещений используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5–2 часов. Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара,. Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170–250оС в течении 1–2 часов.СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТОВРастительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор ,перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра.Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.
Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется для обработки почек, завязей, цветков, семян, Гипохлорит натрия используется для обработки любых эксплантов. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Сулема – токсичное вещество. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями. Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин, ампициллин, левомицитин, каномицин и другие.

36. Каллусные и суспензионные культуры растительных клеток in vitro.
Культура одиночных клеток
Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.
Общие требования к выращиванию : Асептика. Фрагменты ткани или органы растения – экспланты – могут быть ингибированы токсинами микроорганизмов, поэтому все операции должны проводиться в асептических условиях. Для этого чистую посуду и питательную среду стерилизуют в автоклавах. Комнаты обрабатывают хлорамином, а затем ультрафиолетовыми лампами. Растение промывают водой с мылом, споласкивают чистой водой, затем промывают в растворах дезинфицирующих веществ.
Питательные среды. В состав сред входят макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. В среды обязательно вводят ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При приготовлении твердых питательных сред для поверхностного выращивания каллусных тканей используют агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей. Универсальной является среда Мурасиге и Скуга.Типы культур клеток и тканей:
каллусная(поверхностное культивирование)а)плотные ткани,б)средней плотности,рыхлые,2суспензионная
Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением дедифференцированных клеток. Дедифференцировка – основа для создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться.
Общая характеристика каллусных клеток. Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу всех других клеток: деление, растяжение, дифференцировку, старение и отмирание. Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют многие физиологические особенности, свойственные клеткам растения,у каллусных клеток появляются свои, характерные для них, особенности.
Физиологическая асинхронность заключается в том, что в каждый данный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют.
Генетическая гетерогенность – нестабильность генома. Генетически стабильными считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при культивировании могут возникать полиплодия, анеуплодия, хромосомные изменения, генные мутации.
Полиплодия – наследственное изменение, заключается в кратном увеличении числа наборов хромосом в клетках организма Анеуплодия – различные формы аномалий в числе хромосом.
Гормоннезависимость. при длительном культивировании практически у всех тканей может возникнуть специфическое свойство гормоннезависимости, то есть автономности по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов,Такие Клетки называют «привыкшими». Ткани, образованные такими клетками, называют «химическими» опухолями.
37. Морфогенез в культуре каллусных клеток растения
Морфогенез – возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток. Также могут образовываться отдельные ткани или органы (тогда это органогенез).Все типы дифференцировки базируются на свойстве тотипотентности: любая растительная клетка содержит полный набор генов, характерный для того организма, из которого она была выделена.
Потенциальные возможности всех клеток растения одинаковы: каждая может дать в определенных условиях начало целому организму. Все каллусные клетки, готовые ко вторичной дифференцировке, то есть детерминированные, характеризуются общими чертами. Эти клетки образуют утолщенную клеточную стенку, обособляясь от остальных каллусных клеток. Для них характерно более крупное ядро, большее количество запасных веществ, меньшие размеры вакуолей.
Гистогенез (образование тканей). Главную роль в преобразовании каллусных клеток в сосудистые элементы играют фитогормоны, в основном, ауксины. Органогенез. Преобладание концентрации ауксина над цитоксином вызывает дифференцировку клеток, приводящую к образованию корневой системы. В этом случае регенерация целого растения не происходит. При увеличении концентрации цитоксина и уменьшении ауксина начинается стеблевой органогенез и образование побега. Если его пересадить на свежую питательную среду с преобладанием ауксина, то наблюдается образование корней и регенерация целого растения.
Морфогенез можно получить только при условии подбора оптимальной питательной среды, определенных физических факторов, балансе фитогормонов, присутствии сигнальных белков и белков-акцепторов в клетках. Соматический эмбриогенез. В этом процессе образуется зигота. Регенерант, образующийся из соматического зародыша, полностью сформирован. Соматические зародыши представляют практический интерес, так как используются для получения искусственных семян.38. Изолированные протопласты, их получение, и особенности культивирование, применениеПротопласты можно выделить из клеток растительных тканей, культуры каллусов и суспензионной культуры. Для получения жизнеспособных протопластов необходимо поместить их в осмотический раствор. В этом случае тормозятся метаболизм и регенерация клеточных стенок.Изолированные протопласты можно культивировать. На питательной среде у протопласта образуется клеточная стенка, после чего он ведет себя как изолированная клетка и способен делиться и формировать клон клеток.
Метод культуры изолированных тканей широко используется в сельском хозяйстве и промышленном производстве. Примером может служить массовое клонарное микроразмножение плодоовощных и декоративных растений, а также их оздоровление от вирусных и других инфекций. С помощью культуры изолированных клеток in virto можно расширить возможности селекционной работы: получать клоны клеток, а затем и растения с запрограммированными свойствами. Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные метаболиты, возникла отрасль промышленности, осуществляющая биосинтез веществ, необходимых человеку.

39. методы БТ растений микроклональное размножение и оздоровление растений. Микроклональным размн.(МКР) называют неполовое размн. раст с помощью метода культуры тканей, позволяющее получать раст идентичные исходному. В основе получения таких раст лежит способность соматических клеток раст полностью реализовывать свой потенциал развития. МКР имеет преимущества:
1.Высокий коэффициент разм. Одно раст герберы за год при МКР дает до 1 млн новых растений, тогда как при обычных способах размн — только 50 — 100 растений
2.Получение генетически однородного посадочного материала
3. Возможность оздоровления раст, освобождения их от вирусов благодаря клонированию меристематических тканей. 4. Возможность размн раст, которые в естественных условиях репродуцируются с большим трудом.
5.Воспроизведение посадочного материала круглый год, что значительно экономит площади, занимаемые маточными и размножаемыми растениями.
6. Сокращение продолжит-ти селекционного периода, ускорение перехода раст от ювенильной фазы развития к репродуктивной.
Обязательное условие МКР — использование объектов, полностью сохраняющих генетт-ю стабильность на всех этапах процесса. Процесс МКР можно подразделить на 3 этапа:1) Получение хорошо растущей стерильной культуры.2) Собственно размножение, 3)Подготовка к высадке в поле или к реализации.
МКР растений проводят разными способами. 1) основной способ — активизация пазушных меристем(снятии апикального доминирования и активизации развития меристем, существующих в растении). 2) индукция развития адвентивных почек, т. е. почек, возникающих из растит-х клеток и тканей, которые их обычно не образуют.
Оздоровление начинается с момента стерилизации экспланта в асептических условиях бокса, обработка антибиотиками (освободиться, от бактерий, грибных инфекций, нематод). Вирусы, вироиды, микоплазмы остаются в тканях инфицированных раст. В настоящий момент культивирование меристем побега – наиболее эффективный способ оздоровления растит материала от вирусов, вироидов и микоплазм.
В большинстве случаев для уничтожения инфекции приходится воздействовать на раст: температурой а также культурой ткани в комплексе с хемитерапевтической обработкой, а уже потом выделять меристему и получать из нее совершенно здоровое растение – регенерат. Чем больше размер экспланта, тем легче идёт морфогенез, в результате которого получается целое раст, но тем больше вероятность присутствия вирусов в экспланте. У многих сортов раст зона, свободная от вирусных частиц, различна. иногда не удаётся найти оптим-е соотношение м/у размером меристематического экспланта и морфогенезом в нём и избавиться от вирусной инфекции. Приходится дополнять метод культуры меристем термо- или (и) хемитерапией. Лучшие результаты даёт совместное применение культуры тканей и хемитерапии. При внесении в пит. среду препарата «Вирозол» количество безвирусных раст увеличивается до 80-100%, без вышеуказанных нарушений.
В наст. время для диагностики вирусных раст используют иммуноферментную технику, моноклональные АТ, метод молекулярной гибридизации меченых фрагментов РНК- и ДНК-вироидов и вирусов с вирусами тестируемого объекта. Эти методы очень чувствительны, дорогостоящие. После оздоровления норм раст регенеранты размножают обычными методами МКР. Лимоны и апельсины оздоровляют и размножают, используя прививки меристем размером 0,14-0,18 мм на пробирочные подвои, полученные из семян. Достоинство такого подхода состоит в том, что развивающиеся из меристем побеги не имеют ювенальных признаков, при этом цветение и плодоношение ускоряются. 

40.Методы БТ растений в селекции и растениеводстве:Оплодотворение in vitro, эмбриокультура, эксперементальная гаплоидия.
Одно из направлений клеточных технологий — это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами:
1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.);
2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на раз ных этапах развития и т. д.).
Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами:
а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой;
б) завязь вскрывается и на питатель ную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца.
Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу.
Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.
Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.

41 Методы БТ растений в селекции и растениеводстве: Гибридизация соматических клеток
Создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.
Для культивирования протопластов здесь применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования.
В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача - получение из каллусной ткани растений-реге-нерантовПротопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей.
Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро - одного. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения.
При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача - выделить из общей массы гибридные экземпляры. Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови.

42. Методы сохранения генофонда
При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro.
Существует разные подходы к сохранению культур:
- криосохранение, замедление роста, сушка – для клеток микроорганизмов.
Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте.
Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:
- вид и тип клеток, их концентрация в суспензии, состав среды для консервирования, вид и концентрация криопротектора, режим охлаждения и отогрева, способ реабилитации клеток после отогрева.
Клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста Значение имеет и плотность замораживаемой суспензии.
Замораживание производят в специальных аппаратах.
Замедление роста:
1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).
2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда
3. Изменение светового режима.
4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.
5.Применение гормональных и осмотических ингибиторов
43. Использование культур изолированных клеток и тканей для синтеза вторичных метаболитов.
Культура кл и тканей – это искусственное in vitro индуцирование делений кл или выращивание в пересадочной культуре тканей, возникших путём пролиферации клеток изолированных сегментов разных частей растения.
Все объекты, культивируемые in vitro, выращиваются стерильными. Стерилизуются исходные кусочки ткани растений (экспланты), питательная среда; антисептически в специальных боксах стерильным инструментом проводятся манипуляции по выращиванию объектов. Сосуды в которых культивируются ткани и клетки, закрываются так, чтобы предотвратить инфицирование в течение продолжительного времени.
В культуре тканей лекарственных раст можно выделить три главных направления: (получение недифференцированной каллусной массы; создание источников генетического разнообразия форм растений;клеточную селекцию и клональное микроразмножение растений).
В природе каллусообразование – естественная р-ция на повреждение раст. В культуре изолированных тканей при помещении экспланта (т. е. фрагмента ткани или органа) на питательную среду его клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную массу – каллус. В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста. В результате получают культуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя её на трансплантаты и пересаживая её на свежую среду. Каллусы легко образуются на эксплантах из различных органов и частей растений: отрезков стебля, листа, корня, проростков семян, фрагментов паренхимы, тканей клубня, органов цветка, плодов, зародышей и т. д. Культивирование каллусных клеток проводят главным образом двумя способами: на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках (силикагель, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретан и др.) и в жидкой питательной среде. В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и даёт начало так называемой суспензионной культуре.
Влияние генетических, физических и химических факторов на рост и развитие культуры клеток и тканей, на синтез вторичных метаболитов
На культивирование клеток оказывают влияние многие факторы, такие как: генетика экспланта (выбор вида растения, выбор конкретного растения донора); эпигенетика экспланта (выбор органа растения); генетика популяции клеток (культивирование (селекция) культуры, получение мутантов); физиология популяции клеток (оптимизация условий (химических и физических факторов) роста и синтеза вторичных соединений)
А) Химические факторы (Углеводное Минеральное питание. Фитогормоны.РН среды)
Б) Физические факторы (Аэрация; Температура; Свет)
В) Генетические факторы.
Тема является очень перспективной для фармацевтической промышленности, так как продуктивность культуры тканей можно регулировать, а значит количество необходимого соединения будет гарантировано. Кроме того культуры защищены от внешних неблагоприятных факторов, способных снизить качество сырья. Процесс сбора и обработки такого сырья значительно упрощается за счёт культивирования только нужной ткани растения в стерильных условиях. Проблемой является трудоёмкий процесс отбора необходимой ткани и разработки среды для получения оптимального результата.
44.Особенности культивирования клеток.
При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего могут возникнуть следующие проблемы: Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность .Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.
Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассажирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты(амфотерицин Б).Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH. Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.
Пассажирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма. Суспензивные культуры пассажировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует отделить от субстрата и разделить их скопления. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТА или другие ферментные смеси, иногда достаточно только ЭДТА в физиологическом растворе (раствор Версена). Если культура растет медленно, ее обычно подкармливают без переноса в другой сосуд, периодически (обычно раз в 2-3 дня) отбирая часть использованной среды и добавляя свежую.
Трансфекция и трансдукция.В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путем трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла. Этот метод называется трансдукция.

45. Методы б/т в животноводстве: трансплантация эмбрионов.
Позволяет решить задачу рационального использования животных производителей. Технология трансплантации эмбрионов включает следующие этапы:
1.Стимуляция суперовуляции, в организме имеется от 100-1000 половых клеток, но не все дают потомство, однако все фолликулы реагируют на гормоны и созревают, поэтому множественная обработка половых клеток ведет к суперовуляции.
2.Осемеляция донора :осуществляется через 4-5 суток ,после первой инъекции гормонов. для повышения оплодотворения применяют лапароскоп.
3.Извлечение эмбрионов. Существует 2способа 1) хирургический (достоинство - можно сразу после овуляции). 2) нехирургический (с помощью котетора, не ранее 5 дня с момента осеменения). Хранят в питательной среде с антибиотиками и с добавлением эмбриональной сыворотки. Для коров могут использовать нехирургический, позволяет использовать донора 6-8 раз в год и извлекают 3-6 эмбрионов. для овец и свиней хирургический.
4.Хранение эмбрионов. В производственных условиях извлекают утром и пересаживают вечером, хранят в фосфатном буфере, при комнатной температуре, переносят снижение температуры до 0С (если вечером пересаживают). При необходимости длительного хранения эмбрионы замораживают при темп.-1960С и ниже (проходит многоступенчато, т.е постепенно охлаждают и помещают в жидкий азот) оттаивание проходит так же многоступенчато, медленно. Хранятся эмбрионы на стадии морулы и бластоцисты.
5. Пересадка эмбрионов. Существует так же 2 способа:
-хирургический и -нехирургический как в случае извлечения эмбрионов.
46. Методы б/т в животноводстве: оплодотворение in vitro.
Этот метод открывает возможности получения большого числа эмбрионов у животных с большим генетическим потенциалом. На основе оплодотворения in vitro можно получит желаемое количество однояйцовых близнецов и повышать эффективность семени. Стадии оплодотворения:
1.Созреваниие ооцитов in vitro(только ооциты крупнорогатого скота)Получают из яичников после убоя, либо в течении жизни. созревают в течении суток на среде, имеющей сыворотку крови, антибиотики и гранулярные клетки
2.Капацитация сперматозоидов. Капацитация - это процесс физиологического изменений в сперме и приобретения способности к оплодотворению. Проводиться с помощью гипориноподобных веществ.
3.Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов. Основным критерием для установления оплодотворения является образование 1ого и 2ого порядка телец мужского и женского пронуклеусов. Ооцит помещают в каплю среды и вводят суспензию сперматозоидов в концентрации 1 к 1,5 миллионам. Через 44-48 часов определяют наличие дробления ооцитов. Эмбрионы помещают на моноклональный эпителий клеток на 5 дней. Первый теленок был получен таким методом в 1982 году

47. Методы б/т в животноводстве: клеточная инженерия.
Число потомков у 1 особи высших животных бывает небольшим, а комплекс генов ,которые определяют высокую продуктивность возникает редко и может не сохраняться и изменяться. Ядро соматической клетки обладает полной генетической информацией о организме и гене. Созданием условий для ее реализации. То есть можно получить большое количество копий с 1 особи, т.как ядра соматических клеток находятся в дифференцировочном состоянии. Эту задачу можно решить с помощью эмбриональных клеток, когда еще не произошла их дифференциация. Существует несколько способов получения однояйцовых близнецов
1.Микрохирургическое разделение на ранних стадиях развития на 2 и более частей(дуплет эмбрионов).На более поздних стадиях развития уменьшается вероятность получения бластоцист до стадии рождения. Показано, чем продолжительнее этап культивирования, тем меньше жизнеспособность эмбрионов. Разделенные эмбрионы можно хранить в замороженном состоянии. Первый клон получен в США в 2001 г. На кошке.
2.Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер в энуклеированной яйцеклетке. Техника получения монозиготных близнецов имеет ряд ограничений: -клонирование не высоко продуктивного родителя его потомок, признаки которого еще точно неизвестны, -максимальное количество особей 3-4 от одного эмбриона, -последовательное разделение эмбрионов сопровождается формированием структуры бластоцист меньшего размера с меньшим количеством клеток. Стадии клонирования эмбрионов путем пересадки ядер в энуклиированную яйцеклетку:
1.выделение интактного ядра донора
2.энуклеация ооцита
3.пересадка ядра в энуклиированную яйцеклетку
4.активация ооцита и слияние мембран ядра яйца и ооцита под действием электрического тока.
Преимущества метода:
1.отдельные эмбриональные клетки полученные из эмбриона на стадии 64 клеток могут быть репрограмированы в одноклеточные зиготы и могут дать множественные копии генетически однородных животных
2.повторное клонирование путем пересадки от клонированных эмбрионов повышает потенциальные возможности технологий в производстве большого числа копий.
3.можно получить клон определенного пола.
4.эмбрионы полученные от различных генетических линий могут быть заморожены и разморожены после тестирования клона на продуктивность Использование эмбриональных стволовых клеток - перспективное направление ,такие клетки способны к пролиферации в культуре и сохранят способность к дифференцировке в условиях in vitro и in vivo.
3.Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных. Несовместимость может быть преодолена с помощью микрохирургии путем получения химерных эмбрионов (овец, коров разных пород)

48.Технология рекомбинантных ДНК. Ферменты и способы конструирования.
Под рекомбинантными ДНК понимают, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.Ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены специфичности, экспериментатор может сочетать фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.
Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:
1. с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
2. синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
3. ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
4. ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.
Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.
1.Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод). Комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями.Любые два фрагмента, образовавшиеся под действием одной рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей, но полной целостности двойной спирали не восстановится. Для его восстановления используют фермент ДНК-лигазу.
2.Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод).Тупые концы могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях.Эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам.Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент - концевую трансферазу.
3.Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами.Для сшивки фрагментов некомплементарных друг другу липкие концы, применяют линкеры-химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию.Необходимо соблюдать правила экспрессии генетической информации.Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".Липкие концы можно превратить в тупые(эндонуклеаза S1).

49.техн рек ДНК.способ. получ ген. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Технология рекомбинантных ДНК (молекулярное клонирование). 1. Из организма донора извлекают нужную ДНК, подвергают ее ферментативному гидролизу и извлекают нужный ген. 2. У бактерий или других клеточных структур извлекают вектор (плазмиду) и его разрезают. 3. Вставляют в вектор фрагмент ДНК. 4. Полученную конструкцию вводят в кл хозяина, где она передается потомкам. 5. Получают специфический белковый продукт, синтезируемый клетками хозяина.
Способы получения нужного гена. 1. Химический синтез. определяют последовательность нуклеотидов(НК) ДНК на участке гена и производят его синтез из НК при помощи фермента полимераза-1. в 1969 г. Корана впервые синтезировал участок молекулы ДНК, кодирующий аланиновую т-РНК, а в 1977 г. Бойер синтезировал ген соматостатина человека, а затем и ген инсулина. В 1977 г. В. Гилбертом, а также Ф. Сэнгером был предложен метод секвенирования, т.е. распознавания последовательности нуклеотидов в фрагментах нуклеиновых кислот.
Метод химического синтеза генов оказался трудоемким и малоэффективным. Затем появились быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной, последовательностью НК. Теперь довольно легко можно синтезировать последовательность до 100 НК.
2. Рестрикционный метод, или получение генов с помощью специфических эндонуклеаз – рестриктаз. Эти ферменты открыты в 1953 г. у бактерий. С помощью рестриктаз расщепляют ДНК бактерий другого штамма или клетки-хозяина. К настоящему времени из разных м\орг выделено более тысячи разл. рестриктаз; в ген. инженерии используется около 200. Рестриктазы гидролизируют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называемым сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри сайта, либо в непосредственной близости от него. Из нескольких типов рестриктаз в генной инженерии часто используются рестриктазы двух типов, которые узнают определенную послед-ть ДНК и гидролизуют ее внутри послед-ти сайта рестрикции.
Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восст-ся. Фрагменты с «липкими» концами наиболее удобны для создания рекомбинантных ДНК. Однако рестриктазы не «выстригают» полностью ген и его нужно либо достраивать хим путем, либо отщеплять лишние нуклеотидные послед-ти.
Недостатки метода:1) Достаточно трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену. Наряду с интересующим геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние нуклеотидные последовательности, мешающие использованию гена. Рестриктаза может отщепить часть нуклеотидной послед-сти гена, в результате ген теряет функциональную полноценность.2) Гены эукариот имеют сложное строение: включают экзоны и интроны. Первичная РНК, синтезированная на такой ДНК-матрице, подвергается модификации (сплайсингу), в результате участки, соответствующие интронам, удаляются, а участки, соответствующие экзонам, соединяясь, образуют зрелую матричную РНК. Наличие интронов является препятствием для нормального функционирования трансплантированных генов.3) При обработке ДНК рестриктазами образуется смесь фрагментов. Выделить из нее фрагменты, несущие нужный ген – сложная задача.
3. Ферментативный синтез генов стал возможен после открытия фермента обратной транскриптазы или ДНК-ревертазы (Г. Тёмин, Мизутани, 1970), выделенной из онкогенных вирусов. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК (к-ДНК) на РНК-матрице. Ферментативный синтез генов на основе выделенной из кл м-РНК. Это наиболее широко распространенный метод синтеза генов. Обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной мРНК. Полученную одноцепочечную ДНК (комплементарная ДНК, кДНК) используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы.+ данного метода является то, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Кроме того, легче создать условия, когда кл аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК.
4. Химико-ферментативный синтез (ХФС) генов применяется наиболее часто. Хим путем синтезируют олигонуклеотиды: линкеры, адаптеры, праймеры, промоторы, а гены синтезируют ферментативным методом. Линкеры (соединять) - короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания для ряда рестриктаз. Адаптеры - это линкеры, содержащие более одного сайта узнавания рестриктазой, он предназначен для соединения фрагментов с несовместимыми концами.
Праймеры - короткие одноцепочечные фрагменты, комплементарные началу или концу гена. Промотор (80-10 НК) - фрагмент ДНК, узнаваемый РНК-полимеразой.Данный метод является альтернативой «вырезанию» генов с помощью рестриктаз из нативной ДНК. Метод включает хим синтез коротких одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между НК и сшивку олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с образованием двухцепочечных полинуклеотидов. ХМС позволяет точно воссоздать минимально необходимую последовательность нуклеотидов. Методом ХФСполучены гены соматостатина, А- и В-цепей инсулина, проинсулина и др.

50. Под понятием "вектор".понимается молекула нуклеиновой к-ты, способная после введения в кл к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции. Векторные молекулы (ВМ) должны обладать следующими свойствами:
1) способностью автономно реплицироваться в кл-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном; 2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у кл-реципиента появляются новые признаки, позволяющие отличить трансформированные кл от исходных3) содержать по одному или, самое большее, по два участка (сайта) для различных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов), но не в области, ответственной за их репликацию.векторы можно условно разделить на две группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток.
В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений.
Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из кл в кл, др такой способностью не обладают. Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров.
Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созданы на базе геномов бактериофагов E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, кот можно делегировать или заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. Перенос чужеродных генов в кл животных осуществляется с помощью векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы.
После трансформации, конъюгации необходимо идентифицировать кл, несущие ген-мишень. Отбор кл проводят в две стадии. 1): отбор клеток, несущих соответствующий вектор. Отбор проводится по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Например, детерминанты устойчивости к антибиотикам на векторе позволяют обогатить бактериальную популяцию клетками, содержащими этот вектор, при их высеве на среду с антибиотиком.
2): поиск кл, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используют две группы методов. 1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов: А)определение нуклеотидной последовательности ДНК: из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, в которой проводится поиск участков, несущих этот ген; затем проводят секвенирование части нуклеотидной последовательности гена; В)гибридизация выделенной из клеток ДНК с зондом, который может быть или интересующим геном, или соответствующей ему мРНК. Предварительно изолированную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с одноцепочечным ДНК- (или РНК-) зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК.
2. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном:А)- непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени, или клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые геном;Б)использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень; В)иммунологическая детекция применяется, если искомый ген в составе рекомбинантной ДНК транскрибируется и транслируется, но никак не влияет на фенотип организма.
50.Существует несколько типов векторов:
Бактериальные плазмиды очень маленькие кольцевые молекулы ДНК плазмид длиной несколько тысяч пар оснований.Поскольку плазмидная ДНК значительно меньше хромосомной, ее довольно легко выделить в чистом виде. В присутствии ионов кальция плазмиды легко поглощаются бактериями-рецепиентами, даже если те их никогда не содержали, и в клетках бактериального потомства можно обнаружить много копий поглощенной плазмиды. Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из E. coli. она содержит гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину и тетрациклину, Вирусы.Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую. К таким относятся ДНК-вирусы SV-40 и вирус полиомы. Вирусы являются одними из главных кандидатов на роль векторов для введения чужеродной ДНК. При вирусной инфекции каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем сильных вирусных промоторов, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования.
Существуют гибридные вектора, содержащие ДНК фага и плазмиды. К ним относятся, например, космиды и фазмиды.
Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу(обеспечивая проникновение гибридной ДНК в клетку путем инекции, после чего происходит замыкание ДНК в кольцо и репликация ее по плазмидному типу.
Фазмиды - гибриды между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могутразвиваться либо как фаг, либо как плазпид.
 Вироиды- самые мелкие вирусы, способные к независимой репликации, имеют размеры генома(около 1500 тыс. пар оснований). Они реплицируются ферментами клетки-хозяина, не транслируются в видоспецифичные полипептиды, интегрируются в геном клетки-хозяина.Вироиды заражают персиситентно (не происходит выздоровления). Мигрируют из сайта внедрения в другие части растений, переносятся механически или через клеточный сок, через семена, пыльцу. Вироиды могут размножаться в ядрах.
 Плазмиды агробактерий
В качестве векторов могут использоваться опухолеобразующие плазмиды бактерий. Виды Agrobacterium относящимся к роду Rhizobium. Особенность -один из партнеров специфически видоизменяет свойства хозяина, встраивая свои гены в его геном.
Хлоропластная и митохондриальная ДНК  Хлоропласты и другие пластиды обладают одинаковой генетической информацией, так называемым пластомом. У высших растений он представляет собой замкнутую молекулу ДНК длиной 150 т. н. п., достаточную для кодирования примерно 100 белков. Для синтеза пластид необходимо значительно больше белков. Остальные белки кодируются ядром, синтезируются в цитоплазме и поступают в хлоропласты. Некоторые важнейшие белки хлоропластов состоят из нескольких субъединиц, часть из них синтезируется на рибосомах цитоплазмы и транспортируется в хлоропласт, где они объединяются с другими полипептидами, закодированными в самом хлоропласте и там же синтезируемыми. В отличие от хлоропластной, ДНК митохондрий характеризуются исключительным разнообразием и их величина колеблется от 200 до 2400 т. н. п.. В составе митохондриальной ДНК имеются структурные гены, кодирующие полипептиды, гены рибосомных и транспортных РНК. Однако большая часть белков митохондрий, как и хлоропластов, кодируется ядерными генами.
Транспозо́н — последовательность ДНК, способная перемещаться внутри генома в результате процесса, называемого транспозицией. Транспозоны — один из классов мобильных элементов генома, которые, встраиваясь в геном, могут вызывать мутации, в том числе и такие значительные как хромосомные перестройки. Они играют важную роль в процессах переноса лекарственной устойчивости средимикроорганизмов, рекомбинации, и обмена генетическим материалом между различными видами как в природе (горизонтальный перенос генов), так и в ходе генно-инженерных исследований.. Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень.Необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. После трансплантации генов лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.Первая стадия – поиск клеток, несущих вектор, например, по приобретенной способности быть устойчивыми к антибиотикам.Вторая стадия – поиск клеток, несущих и вектор, и ген-мишень. Для этого используют две группы методов:а) методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:– определение нуклеотидной последовательности ДНК, когда из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, затем проводят секвенирование;– гибридизация выделенной ДНК с зондом, который может быть интересующим геном или соответствующей ему м-РНК;б) методы, основанные на определении признака, кодируемого геном:– непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени;– использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень, например, клетки, несущие ген β-галактозидазы культивируют на среде с лактозой;– иммунологическая детекция, например, при поиске в бактериях α-интерферона человека его связывают с антителами, то есть ген идентифицируют с помощью специфических антител к его белковому продукту.

Приложенные файлы

  • docx 18048483
    Размер файла: 138 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий