mikra


Иммунофлюоресцентный анализ. Один из наиболее чувствительных методов выявления связывания антител с антигенами в клетках и тканях – иммунофлюоресцентный анализ. Специальный иммунофлюоресцентный краситель (флюорохром) прикрепляется химической связью к молекуле специфического антитела, не нарушая его специфичности. Часто используют краситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто - зеленой флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлюоресцентного метода, активируются светом одной длины волны (чаще – ультрафиолетовой части спектра), а сами испускают лучи другой длины волны (видимого спектра). В люминесцентном микроскопе используется в качестве источника света, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.
Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его называют методом экспресс – диагностики.
Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических антител против каждого из изучаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой иммунофлюоресцентный метод, при котором связанные с антигеном специфические антитела (немеченые) выявляются с помощью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген – специфические антитела.
Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент (например, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разложения, видимые в обычный световой микроскоп.
Для использования при электронной микроскопии антиген - специфические антитела можно метить частицами золота, локализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.
При п р я м о м иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов. (рис. 10.1.2)
Н е п р я м о й метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки – антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируется флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечивая его свечение при люминесцентной микроскопии (см. рис. 10.1.2)
На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген – антитело
Аг Аг
+ Ат Ат светящийся
комплекс
а
Аг
Аг Аг
+ Ат + агс

б светящийся
комплекс
Рис.10.1.2. Иммунофлюоресцентный метод Кунса.
а – прямой метод; б – непрямой метод : АГ – антиген, АТ – антитело,
АГС – антиглобулиновая сыворотка.
препарат помещяют во влажную камеру и инкубируют при 37 ᵒ С в течении 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связывающихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, выдерживают в течении 15 мин при 37 ᵒ С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген – антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.
Иммуноферментный анализ. Один из наиболее распространенных в практике методов – иммуноферментный анализ (ИФА) – основан на использовании двух разных по специфичности моноклональных антител против двух разных антигенных эпитопов в составе искомого антигена. В лунке с иммобилизованными антителами против одного эпитопа добавляют материал, в котром ищут антиген. В процессе инкубации на твердой фазе образуется комплекс антиген – антитело. Затем лунки отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела против другого эпитопа того же антигена. После повторной инкубации и отмывания от избытка конъюгата антител с ферментом определяют количество связавшихся антител по их ферментативной активности в присутствии субстрата с индикатором. При этом величина активности фермента пропорциональна концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления иммунного комплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизированных и меченых антител, что послужило поводом для широко распространенного в литературе названия «сэндвич» - метод.
Повышение специфичности и чувствительности иммуноферментного анализа, так же как и иммунофлюоресцентного и радиоиммунного методов, связано с использованием моноклональных антител (МКАТ).
Для получения МКАТ мышей иммунизируют очищенным препаратом антигена, затем выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и проводят слияние их с миеломными клетками – партнерами. Неслившиеся миеломные клетки погибают, так как они дефектны по синтезу некоторых неклеотидов и не могут выжить на селективной среде без этих нуклеотидов. Неслившиеся лимфоциты погибают в культуре из-за отсутствия в среде необходимых им трофических факторов. Выживают только гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от миеломных клеток способность к пролиферации в культуре, а от лимфоцитов – способность к синтезу антител соответствующей специфичности. Надосадочную жидкость культур гибридом исследуют с помощью ИФА с соответствующим антигеном. После выявления клеток, секретирующих нужные антитела, их клонируют методом лимитирующих разведений, т.е клетки разводят таким образом, чтобы получить дочернюю культуру из одной клетки. Тогда все потомство будет генетически идентично: одна клетка дает один клон, который продуцирует МКАТ.
Радиоиммунный анализ. Радиоиммунный анализ (РИА) является чрезвычайно чувствительным методом, который может быть использован для количественного определения любого антигена. Чувствительность метода позволяет выявлять незначительные количества антигена.
Для проведения жидкостного радиоиммунного анализа очищенный известный антиген метят радионуклидами, чаще всего 125 I . В этом случае используют конкурентный вариант связывания, когда для определения количества антигена в исследуемом образце оценивают его способность конкурировать с меченым референс – антигеном в связывании со специфическими антителами. Образующиеся комплексы антиген – антитело выделяют осаждением (сульфатом аммония или антиантителами) и определяют их радиоактивность в сопоставлении с радиоактивностью несвязанного антигена в надосадочной жидкости. Использование ряда концентрации немеченого антигена позволяет построить стандартную калибровочную кривую, с помощью которой определяется концентрация исследуемого антигена.
Более современный метод – твердофазный РИА, при котором специфические антитела фиксируются на тфердой фазе, к ним добавляется исследуемый антиген, а затем меченый стандартный антиген. Определение связанной и несвязанной метки позволяет построить калибровочную кривую и определить количество исследуемого антигена.
РИА широко применяют для количественного опрделения различных веществ: гормонов (инсулина, гормона роста, адренокортикотропного гормона, трийодтиронина, тирксина, эстрогена), белков сыворотки крови (IgE, α – фетопротеина и др.), метаболитов (фолиевой кислоты, циклических нуклеотидов и др.), лекарственных препаратов (дигоксина, дигитоксина, морфина), микробных антигенов (HBsAg).Реакция агглютинации. В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглютинации очень часто применяют для идентификации видов и сероваров (серотипирование) бактерий с помощью диагностических агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации (РА) на стекле (пластинчатая реакция агглютинации) ставится с одним разведением диагностической агглютинирующей счыворотки, которое в зависимости от ее титра составляет 1:10, 1:25, 1:50 или 1: 100.
Предметное стекло делят на квадраты восковым карандашом. В один квадрат наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, в другой – каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2-4 мин. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен и хлопьев агглютината в каплях. Учет производят через 3-5 мин (рис. 10.1.3)
Кроме спецефической агглютинации бактерий, вызванной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию дают R-формы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в результате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне также происходит склеивание – наступает «кислотная» агглютинация. Чтобы исключить возможность учета ложноположительных результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с изотоническим раствором хлорида натрия.
Реакция непрямой гемагглютинации. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительной более высокой чувствительностью, чем реакция агглютинации. ЕЕ используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов – токсинов – в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции спецефических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых платин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3% суспензии нагруженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитов, нагруженными антителами разной групповой специфичности. Через 2ч инкубации при температуре 37 ˚С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции – характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

Реакция преципитации и ее варианты. Реакция преципитации характеризуется осаждением специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген – антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов, поскольку образовавшийся комплекс может раствориться в избытке антигена или антител. Антиген должен иметь характер прозрачного коллоидного раствора.
В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакция преципитации служит главным образом для выявления или идентификации антигена (преципитиногена) по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала (шкуры, шерсть, мясо животных).
Реакция преципитации проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитурующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата – помутнение (табл. 10.1.1).
Таблица 10.1.1. Постановка реакции преципитации (форма протокола)
Ингредиенты, мл Опытная
проба Номер контрольной пробирки
1 2 3 4
Стандартная преципитирующая 0,3 - 0,3 0,3 0,3
Сыворотка
Нормальная кроличья сыворотка - 0,3 - - -
Экстракт исследуемого материала 0,3 0,3 - - -
Стандартный антиген - - - - -Контрольный экстракт - - 0,3 - -
Изотонический раствор хлорида
Натрия - - - - 0,3
Результаты

Реакция кольцепипреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которое вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольцаю В контрольных пробирах преципитат не образуется (рис. 10.1.4).
Реакция преципитации в геле. Чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько лунок на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные – различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При дуффизии реагентов в агаровом геле в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы – дуги преципитации (рис. 10.1.5).
В случае постановки реакции преципитации с различными разведениями антигена можно установить титр прецепитирующей сыворотки – максимальное разведение антигена, которое дает преципитацию с данной сывороткой. Одна из разновидностей реакции преципитации в геле позволяет определить токсигенность исследуемых бактерий, например бактерий дифтерии (см. тему 14.2). При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации в виде дуг (рис. 10.1.6).
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. Вначале проводят электрофоретическое разделение белков в агаровом геле. После разделения в канавку, которая идет параллельно линии миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходных смеси антигенов. ИЭФ – один из широко распространенных методов качественного анализа антигенов. Располагая соответствующими преципитурующими антисыворотками, с его помощью можно исследовать любую антигенную смесь. В частности, успешно анализируются белки сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи, молока, Экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.


Реакция торможения гемагглютинации. Типирование вируса проводят в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором типоспецефических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса гриппа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N3 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток (табл. 10.1.2, 10.1.3).
Таблица 10.1.2. Постановка РТГА для типирования вируса
Манипуляции Номера пробирок
опытные контрольные
1 2 3 4 5 1к 2к 3к
Приготовление разведе- 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:10 - -
ний типоспецифической
сыворотки
Внесение сыворотки, мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - -
Внесение суспензии ви- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - 0,2 -
руса (4 гемагглютини-рующие дозы в 0,2 мл)Внесение изотоническо- - - - - - - 0,2 0,4
го раствора хлорида на-
трия мл,
Экспозиция 60 мин при комнатной температуре
Внесение 1% суспензии 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Эритроцитов курицы, мл
Экспозиция 30-60 мин при комнатной температуре
Учет результатов

Таблица 10.1.3. Результаты ЗТГА при типировании вируса гриппа
Типоспецефическая противогриппозная
сыворотка Разведение сыворотки Контроль
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 сыворотки вируса эритро-
цитовH0N1 - + + + + + + + + + + - + + + -
H1N1 - + + + + + + + + + + + - + + + -
H3N2 - - - - - - + + + -
Условные обозначения: (+ + +) – наличие просветов в ленке; (+ + ) – наличие пленки с фестончатыми краями из склеивающихся эритроцитов; (+) – хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов; (-) – резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля.
Радиоиммунный метод. Количество специфических антител в исследуемом образце можно определить, используя вариант конкурентного связывание: по их способности ингибировать связывание радиоактивно меченных антител со спецефическим антигеном, фиксированным на твердой фазе. Но чаще используют метод выявления связавшихся с антигеном на твердой фазе специфических антител с помощью радиоактивно меченных антииммуноглобулиновых антител, специфичных к константной области молекулы иммуноглобулина. Проще всего получить антииммуноглобулиновую сыворотку путем иммунизации животных одного вида иммуноглобулинами животного другого вида. Такая антииммуноглобулиновая сыворотка будет связывать любые молекулы иммуноглобулинов соответствующего вида (мышей, кроликов или других видов). Такую меченную радионуклидами антииммуноглобулиновая сыворотка «распознает» антитела разной специфичности, связываясь с антигенными эпитопами в константной части молекул.
Используя РИА или ИФА, можно определить не только количество антигенспецифических антител, но и принадлежность этих антител к тому или иному изотопу иммуноглобулинов. Для этого используют антиммуноглобулиновые антитела, специфичные для отдельных изотипов иммуноглобулинов. Получение таких антииммуноглобулиновых антител начинается с иммунизации животного очищенным препаратом одного из изотипов иммуноглобулинов. Из полученной иммунной сыворотки путем многократной абсорбции удаляют все антитела, перекрестно реагирующие с иммуноглобулинами других изотипов. Полученные антиизотопические антитела используют для определения количества антител каждого из изотипов в иммунной сыворотке, реагирующей с антигеном. Особая роль отводится антителам против IgE которые позволяют определить количество иммуноглобулинов этого изотипа и специфических антител, относящихся к этому изотипу, при лабораторной диагностике аллергических реакций анафалактического типа и атопических заболеваний.
Иммуноферментный анализ. Одним из наиболее чувствительных методов выявления антител считается ИФА, который не уступает по чувствительности РИА и в то же время отличается от него большей доступностью для обычных диагностических лабораторий. Специфический антиген адсорбирует на поверхности лунок в пластинах из полистирола (поливинилхлорида). Фиксированный на пластине антиген инкубирует с испытуемыми человеческими сыворотками. После отмывания от несвязавшихся белков связанные иммобилизованными антиенами иммуноглобулиновой сыворотки, меченной ферментом пероксидазой. После инкубации с субстратом (пероксидом водорода) и индикатором оценивают ферментативную активность по интенсивности окраски. Интенсивность окраски, пропроциональную количеству сорбированных на антигене антител, можно оценить визуально или с помощью спектрофотометра. В данной модификации удобна универсальность меченого реагента, который позволяет выявлять антитела к разным антигенам.
Иммуноэлектрофорез. Для выявления антител, специфических по отношению к отдельным антигенным компонентам в составе сложной смеси, например к отдельным антигенам микроорганизмов0 приходятся прибегать к методам выделения белков из смеси. Одним из наиболее популярных методов выделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле ( PAGE) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), который получил сокращенное обозначение: SDS-PAGE. Белковые фракции распределяются в электрофоретическом поле белки переносят на нитроцеллюлярную пластину, где они обрабатываются специфической антисывороткой. Положение белков, с которыми связываются специфические антитела, меченных ферментов или радионуклидом. Этот метод получил название Western blot и используется в качестве уточняющегопри выявлении в сыворотке крови антител против вируса имммунодефицита человека. Для этого белки вируса разделяют с помощью SDS-PAGE, разделенные белки переносят нластину нитроцеллюлозы и проводят инкубацию с испытуемой сывороткой. Антитела из сыворотки связываются с разными антигенными фракциями, что выяляются с помощью ферментно-меченой антиииммуноглобулиновой сыворотки против иммуноглобулинов человека.
Иммунофлюоресцентный метод. Используется, например, в серодиагностике сифилиса. Мазок из взвеси T.pallidum стекле обрабатывают исследуемый сывороткой, в которой подозревается присутствие спецефических антител. Избыток антител удаляют отмыванием. Мазок дополнительно обрабатывают флюресцирующей сывороткой против человеческих иммуноглобулинов. О выявлении специфических антител в исследуемой сыворотке будет свидетельствовать обнаружение всятящихся спирохет при люминесцентной микроскопии мазка.
Реакция развернутой агглютинации. Сначала готовят основное разведение сыворотки из которого делают серию разведений путем последовательного переноса мл из предыдущей пробирки в следующую пробирку ряда. В каждую пробирку с разведениями сыворотки и в контрольнуь пробирку вносят пастеровской пипеткой по Капли взвеси бактерий содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 ч, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции развернутой агглютинации проихводят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают след. знаками: «+ + + +» - полная агглютинация, «+ + +» - неполная агглютинация, «+ +» частичная агглютинация, «+» - слабая, сомнительная агглютинация.
Реакция непрямой гемагглютинации. При работе с растворимыми мелкодисперсными антигенами, или пассивной гемагглютинации. Антиген сначала адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах готовят эритроцитарный диагностикум. Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под деймтвием иммунной сыворотки, содержащей антитела к данному антигену (рис.10.2.2).
Реакция отличается высокой чувстивительностью и позволяет вывлять сравнительно небольшие концентрации антител в исследуемой сыворотке. Реакцию ставят на пластмассовой пластине, в лунках которой готовят последовательные разведения сыворотки больного. В каждую лунку вносят одинаковый объем (0,5 мл) 3% суспензии нагруженных антигенами эритроцитов – соответствующего эритроцитарного диагностикума. Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результат по характеру осадка эритроцитов.

Реакция преципитации в геле. Иммунодуффизия в агаровос геле растворов антигенов и антител, залитых в разные лунки, навстречу друг другу в случиях соответствия их специфичности приводит к образованию специфического преципитата в виде полосок и дуг в местах встречи реагентов.

Как правило, в центральную лунку заливают стандартный раствор антигена, а в периферические – испытуемые сыворотки. В одну из периферических лунок вносят стандартную иммунную сыворотку соответствующего специфичности, а в другую – нормальную сыворотку для контроля. Антиген с сыворотками инкубируют во влажной камере при 37°С в течение 24 ч, после чего учитывают количество и ширину полос преципитации между центральной лункой с раствором антигена и лунками с исследуемыми сыворотками.
Реакция Кумбса. Сложность выявления неполных( моновалентных) антител связана с тем , что эти антитела, связываясь с эпитопами специфического антигена , не образуют структуру решетки и реакция между антигенами и антителами не выявляется ни агглютинацией , ни приципитацией ни другими тестами. Для выявления образовавшихся комплексов антиген-антитело

приходится использовать дополнительные тест-системы. Для выявления неполных антител , например к ресуз-антигену эритоцитов в сыворотке крови беременной женщины, реакция ставится в два этапа : 1) к двукратным разведениям разведениям испытуемой сыворотки добавляют эритоциты , сожержащие ресуз-антиген , и выдерживают 37˚С в течение часа ; 2) к тщательно отмытым после первого этапа эритроцитам добавляют кроличью античеловеческую антиглобулиновую сыворотку ( в заранее оттированном рабочем разведении ) . после инкубации в течении 30 мин при температуре 37˚С результаты оценивают по наличию гемагглютинации ( положительная ракция ). Необлионовая сыворотка + заведомо сенсибилизированные специфическими антителами эритроциты + антиглобулиновая сыворотка ;3) обработанные иследуемой сывороткой ресуз-отрицательные эритоциты + антиглобулиновая сыворотка (рис. 10.2.5.).
Реакция флоккуляции . В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя (инициальная ) флоккуляция происходит в пробирке , где антиген и антитело соджержатся в э к в и в а л е н т н ы х соотношениях.
Рекцию ставят в два этапа. Сначала по стандартной сыворотке устанавливают пороговую велечину флоккуляции Lf
(Limes flocculationis) в мл токсина. Lf токсина определяется его минимальным количеством , которое дает инициальную флокуляцию с 1 международной единицей ( МЕ ) сыворотки установив силу токсина , приступают к титрованию антитоксической сыворотки. Известной силы токсин и испытуемую денном объеме. Как показано в табл. 10.2.3. Пробирки выдерживают в водяной бане при температуре 45˚С в течение 30 мин до выпадения хлопьев в одной из них.
Таблица 10.2.3. Реакция флоккуляцииМанипуляции Номера пробирок
1 2 3 4 5 6 7
Внесение раствора токсина, 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
содержащего 20 Lf в 1 мл
Внесение исследуемемой 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - 0,6
сыворотки, мл
Инкубация при температуре 45°С в течение 30 мин
Учет результатов по инициальной
флоккуляции Инициальная флоккуляция проявляется в той пробирке , где количество токсина соответсвует количеству международных единиц сыворотки. Например, флоккуляция произошла в 3-й пробирке, значит , в 0,4 мл сыворотки находится 40 МЕ. Следовательно . 1 мл сыворотки содержит 40: 0,4=100 МЕ.
Антистрептолизоновая реакция. Реакция основана на феномене н е й т р а л и з а ц и и гемолитическую дозу токсина (О-стрептозилина) антитоксическими антителами имунной сыворотки
Для постановки реакции предварительно определяет минимальную гемолотическую дозу токсина (О-стрептозилина ),т.е. наименьшее его количество, которое вызывает гемолиз 0,2 мл 5% взвеси эритоцитов кролика, Затем определяют рабочую дозу О-стрептизолина, т.е. наибольшее количество токсина, которое в смеси с 12 АЕ (антитоксической единицы) стандартной антитоксической сыворотки полностью нейтрализуется и не вызывает гемолиза эритроцитов. Для постановки основного опыта готовят разведения исследуемой сыворотки, к каждому из которых добавляют рабочую дозу токсина, инкубируют 45 мин при 37˚С и 18 ч при комнатной температуре. Обязательным является контроль на возможность спонтанного гемолиза эритроцитов. В качестве положительной учитывается реакция , где отсутвует гемолиз. С учетом максимального разведения сыворотки, при котором наблюдается полная задержка гемолиза , расчитывают содержание АЕ в 1 мл испытуемой сыворотки (см. табл. 12.1.3.).
12.Реакция торможения гемагглютинации. РТГА основана на том , что при ваимодействии вирусных антигенов ( гемагглютинов) со специфическими антителами имунной сыворотки происходит блокирование (нейтрализация) гемагглютинации.
Развернутая РТГА проводится в лунках пластмасовых пластин. Предварительно определяют титр вирусного антигена в реакции гемагглюции с целью выбора рабочей дозы. Рабочее разведение берут в 16 раз меньше титра. В лунках готовят 2-кратные разведения исследуемой сыворотки в объеме0,25 мл, добавляют по0,25 мл взвеси вируса в рабочем разведении и инкубируют 0,5 мл 1% взеси куриных эритроцитов, инкубируют ещё 2ч и оценивают результат по феномену гемегглютинации. При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА.
Разные методы количественного определения антигенов и анти тел существенно различаются по чувствительности, т.е. по тому минимальному количеству антигенов или антител. Которое может быть выявлено с помощью данного метода (табл.10.2.4).

Таблица 10.2.4. Сравнительная чувствительность разных методов количественного определения антител и антигенов
Тесты Выявляемое количество, мкг/мл
Антител антигенов
Преципитация 20,2 1,0
Иммуноэлектрофорез 20,0
Связывание комплемента 0,5
Радиальная иммунодиффузия 0,05 0,5
Агглютинация бактерий 0,01
Гемолиз 0,01
Непрямая гемагглютинация 0,01
Ингибиция гемагглютинации 0,001
Нейтрализация токсина 0,01
Радиоиммунный анализ 0,0005 0,000005
Иммуноферментный анализ 0,0005 0,000005
Нейтрализация вирусов 0,000005

Приложенные файлы

  • docx 17903390
    Размер файла: 709 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий